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研究目的肝门部胆管癌(hilar cholangiocarcinoma,HC),即Klatskin瘤(Klatskin tumor,KT),是指肝总管、左右肝管及其汇合部发生的恶性肿瘤。肝门部胆管癌早期症状和体征隐匿而不典型,患者在临床诊断时多已属中晚期,肿瘤往往已经出现转移;肝门部胆管癌治疗效果有限且预后差。因此探索肝门部胆管癌的发生和发展机制,以及寻找与肿瘤复发和预后相关的新的生物标志物,具有实质性的临床研究意义。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白1(secreted protein acidic and rich in cysteines-like protein 1,SPARCL1)是一种细胞外基质分泌的糖蛋白,具有参与细胞黏附、迁移和增殖的调控等多种生物学功能。SPARCL1的表达可以在全身多个组织脏器中被检测到,SPARCL1表达缺失或下调在胃癌、结肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中多次被报道,被认为可能是肿瘤抑制因子;但是也有一些研究报道SPARCL1在肿瘤细胞中的表达是上调的。有研究发现SPARCL1的表达与肿瘤细胞增殖活性增高、血管和细胞周期进程相关,然而目前对于SPARCL1在肝门部胆管癌中的表达研究有限,SPARCL1的表达在肝门部胆管癌发生发展中起着怎样的作用机制尚不明确。因此本研究拟将关注点聚焦于SPARCL1在肝门部胆管癌中的表达情况,以及SPARCL1表达对于肝门部胆管癌发生发展的作用机制。研究方法:本研究通过三部分的实验来完成对SPARCL1在肝门部胆管癌中的表达情况,以及SPARCL1表达对于肝门部胆管癌发生发展的作用机制研究。1、通过比对92例肝门部胆管癌患者的SPARCL1表达与患者基本情况、肿瘤大小、肿瘤分期(包括T分期、N分期)、组织细胞分化,来分析SPARCL1的表达与肝门部胆管癌患者临床病理特征相关性;应用免疫组织化学法检测92例肝门部胆管癌患者组织标本的SPARCL1表达,并通过Western Blot对肝门部胆管癌细胞的SPARCL1表达程度作分析确认。2、通过在体外SPARCL1质粒转染肝门部胆管癌细胞(QBC939细胞)后的细胞增殖实验和迁移实验来研究SPARCL1过表达对肝门部胆管癌细胞增殖和转移的作用;并通过检测细胞外基质相关蛋白酶,包括基质金属蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9,MMP-9)、基质金属蛋白酶-2(matrix metallopeptidase 2,MMP-2)、波形蛋白(Vimentin)和纤维连接蛋白(Fibronectin)等的表达,进一步明确SPARCL1表达变化对肿瘤细胞发生发展的作用机制。3、通过对肝门部胆管癌患者SPARCL1表达与预后和生存期的统计分析来研究两者之间的相关性。实验结果1、SPARCL1表达与肝门部胆管癌的淋巴结转移和组织分化类型显著相关,而与性别、肿瘤大小和肿瘤分期无显著相关;通过免疫组化学法检测并通过Western Blot分析确认,SPARCL1在正常胆管细胞表达为强阳性;在肝门部胆管癌中的表达下降,在50%的肝门部胆管癌样本中,SPARCL1表达缺失。2、SPARCL1质粒转染QBC939细胞并经过2周的培养后,可以在克隆形成实验中发现,经SPARCL1转染的QBC939细胞的克隆形成能力低于对照组;经SPARCL1转染的QBC939细胞的细胞活力较对照组有下降趋势。SPARCL1质粒转染的QBC939细胞在Transwell迁移实验中,迁移细胞数显著少于对照组;划痕实验进一步证实了SPARCL1质粒转染的QBC939细胞在迁移能力低于对照组;SPARCL1过表达抑制QBC939细胞迁移的作用机制可能通过抑制MMP-9、MMP-2、波形蛋白和纤维连接蛋白而起作用。3、SPARCL1表达阳性的肝门部胆管癌患者比SPARCL1表达阴性的患者肿瘤再次复发时间更长(32月vs.12月,p=0.001)、中位生存期更长(40月vs.13月,p<0.001)。COX多因素分析显示,肿瘤的浸润程度、淋巴结转移和SPARCL1表达是肝门部胆管癌预后的独立预测因子。结论1、SPARCL1的表达在肝门部胆管癌中是下调的,在约一半肝门部胆管癌患者中其表达缺失;2、SPARCL1过表达对肝门部胆管癌细胞的增殖和迁移能力有抑制作用,这种作用可能与抑制细胞外基质蛋白,如MMP-9、MMP-2、波形蛋白和纤维连接蛋白有关。3、SPARCL1阳性表达的肝门部胆管癌患者比SPARCL1阴性表达的患者具有更长的复发时间和生存期;SPARCL1可以作为肝门部胆管癌复发和生存期的预测因子之一。