西藏簇角缨象天牛气味结合蛋白基因的鉴定和功能分析

来源 :西南林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lunxyxd
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昆虫嗅觉调控害虫的防治策略已经在农林业上得到广泛运用,昆虫的嗅觉系统在配偶识别、准确寻找寄主和产卵地点选择方面发挥着极其重要的作用。昆虫的气味结合蛋白(OBP)是一类存在于其嗅觉感器淋巴液中的一种小分子蛋白,在昆虫的嗅觉识别过程中起着重要的作用,它能准确识别并结合环境中的气味物质。西藏簇角缨象天牛Cacia cretifera thibetana是严重危害云南核桃等经济林木的主要蛀干害虫之一,带来严重的生态和经济利益损失。目前,西藏簇角缨象天牛的防治方法主要采取化学药剂喷杀、人工剪去枯枝等,大量使用化学农药使该虫产生抗药性,而且残留的农药严重污染生态环境。综上所述,急需寻找一种绿色高效措施对西藏簇角缨象天牛进行防治。而植食性昆虫依靠嗅觉系统定位危害寄主植物,进行化学信息的交流,昆虫的OBP基因在嗅觉系统中发挥不可替代作用,为了阐明西藏簇角缨象天牛的嗅觉识别分子机制,本研究对西藏簇角缨象天牛的头部和前足感器进行电镜扫描,并对触角、头、胸、腹、足和翅等组织进行转录组测序,利用分子生物学和生物信息学鉴定到31个OBP基因,对11个OBP基因进行表达研究,并对OBP6和OBP10的气味结合特性进行了研究。主要结果如下:(1)通过扫描电镜观察西藏簇角缨象天牛雌雄成虫的触角、下颚须、下唇须和前足感器的类型、形态结构和分布。结果显示,西藏簇角缨象天牛雌、雄成虫的感器类型没有差异,触角上共有3类12种感器,分别为1种毛形感器、5种刺感器、6种锥形感器;前足上有2类5种感器,分别为4种刺形感器、1种毛形感器;下颚须和下唇须上均观察到5类9种感器,分别为1种氏鬃毛感器、3种刺形感器、4种栓锥形感器、1种钟型感器和1种板形感器。(2)利用Illumina Hiseq TM 2000高通量测序平台对西藏簇角缨象天牛雌雄成虫的触角、头、胸、腹、足和翅等组织进行转录组测序。测序共获得碱基序列约262.04G,原始序列1,750,709,884条,去除杂质后获得1,747,731,270条Clean reads,拼接后得到89,897条Unigenes,Unigenes的平均长度为1,036bp,N50为1,626bp。对获得的89,897条Unigenes进行功能注释,有33,735个Unigenes注释到NR数据库中,其中有41.0%的Unigenes与赤拟谷盗相似,有10.9%的Unigenes与中欧山松大小蠹相似,有2.0%的Unigenes与双叉犀金龟相似,其它物种占42.9%。29,374个Unigenes基因在GO数据库中得到注释,按照功能分为生物学过程、细胞成分和分子功能56个亚类,15405条Unigenes注释到KOG数据库中,一般功能的基因数量最多,共有2076个,未命名蛋白的基因最少,仅有3个,26812条Unigenes注释到KEGG数据库中共有229条通路。(3)利用生物信息学的方法从西藏簇角缨象天牛雌雄成虫的转录组中鉴定到31个OBP基因,依次命名为Ccre OBP1-Ccre OBP31,除Ccre OBP29、Ccre OBP30和Ccre OBP31外,其它28个OBP基因均可以预测到完整的开放阅读框,编码123244个氨基酸残基,氨基酸一致性在4%-86%之间,它们分为三个家族,4个Plus-C OBP家族,8个Classic OBP家族,14个Minus-C家族;选取在西藏簇角缨象天牛雌雄成虫触角、足和翅等组织中高表达的11个OBP基因,采用荧光定量PCR技术研究11个OBP基因分别在西藏簇角缨象天牛雌雄成虫的触角、头、雄、腹、足和翅等组织的表达水平,q PCR的结果表明,Ccre OBP6、Ccre OBP10、Ccre OBP28、Ccre OBP30和Ccre OBP31在西藏簇角缨象天牛雌雄成虫的触角中特异高表达,其它6个Ccre OBP基因在至少两个组织以上均有表达。(4)采用同步蒸馏萃取法和气质联用仪(GC-MS),测定了西藏簇角缨象天牛寄主核桃树的皮和叶的挥发性成分,从核桃树皮和树叶提取物中共检出了69种化合物。选择西藏簇角缨象天牛雌雄成虫触角特异高表达的Ccre OBP6和Ccre OBP10基因进行原核表达和纯化,N-苯基-1-萘胺(1-NPN)作为荧光探针,用荧光竞争结合实验测定Ccre OBP6和Ccre OBP10蛋白与寄主中具有活性的20种小分子化合物的结合特性。结果表明,Ccre OBP6与氧化石竹烯、1,6-环癸二烯、正己醛和叶绿醇等4个化合物不结合,与其它16个化合物均有结合,其中与松油醇和反式-2-己烯醛的结合能力最强,Ki分别为15.64和12.90μmol/L;Ccre OBP10与正己醛和叶绿醇不结合,与其他18种化合物均有结合能力,其中与香叶醇的结合能力最强,Ki值为12.73μmol/L。本研究获得了西藏簇角缨象天牛的OBP基因信息,研究了在其触角特异高表达的Cct OBP6和Cct OBP10蛋白功能,为利用化学生态学手段防治西藏簇角缨象天牛奠定了基础。
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