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在烟草栽培过程中,为了得到高质量的烟叶,烟株打顶是农业生产中的一种常规措施。先前的研究表明,打顶使很多生长过程发生了改变,诸如激素源平衡、根系发育、库源关系、烟碱合成能力及抗逆性等,而根系烟碱合成能力增加又会降低上部烟叶的工业可用性,另外烟碱除用于吸食外,也广泛应用于生物农药和化工产品。因此研究烟株打顶诱导烟碱生物合成的调控机制具有重要意义。为了探究烟根响应打顶的分子机制,运用Solexa Illumina技术对烟草打顶后0、2、6、24h根尖组织DGE进行分析,推测烟草根系发育和烟碱合成的调控机制。主要内容如下:1.通过转录组测序技术,获得了超过360万个raw tags,过滤掉接头序列、空标签、低质量的标签和单拷贝序列,产生超过340万个Clean tags。其中distinct clean tags有30-40万个。四个表达文库总量和distinct clean tags数量在DGE文库中有相似的分布情况。以烟草GSS作为参考基因数据库,其中57%-62%不同的clean tags可以唯一定位到参考序列上,四个文库比对到参考基因数据库的tags数目分别为158,626,153,034,151,455和145,294。2.烟草打顶响应相关基因的筛选。比较打顶后2、6、24小时与0小时(即未打顶)的基因表达谱,差异表达基因的数目随打顶时间延长而增多,其中有146个基因只在打顶2h后表达量有改变,为早期打顶响应基因;有770个基因只在打顶24h后表达量有变化,为晚期打顶响应基因。3.对差异表达基因进行GO和pathway分析,发现有178个已知基因与烟草打顶响应相关,其中73个与胁迫相关、43个与刺激相关、12个与次生代谢相关、28个与植物信号传导相关、22个与发育相关。4.利用荧光定量技术鉴定筛选出的打顶响应基因。选出15个代表基因,这些基因均与打顶后的一些生物过程有关,例如JA信号通路、IAA信号通、防御反应、植物发育和次生代谢。qRT-PCR结果与DGE数据一致。5.结合SSH文库分析DGE文库中差异表达基因。发现在DGE文库中,有49个匹配到基因的tags与SSH文库中的差异表达基因一致,这些差异表达基因有着不同的生物学功能,包括信号传导、防御或抗胁迫及其他的代谢过程。6.NAC1转录因子是miR164a的靶基因,可以调控生长素信号进而促进侧根发育。打顶前后的DGE和qRT-PCR的结果都表明,打顶后Nta-miR164a表达明显被抑制,而NtNAC-R1明显被诱导,表明NtNAC-R1和Nta-miR164a在烟根对打顶的响应中起重要作用。7.NtGRAS-R1是Nta-miR171d的靶基因,qRT-PCR结果显示打顶后Nta-miR171d诱导表达明显,而NtGRAS-R1受到抑制显著,表明Nta-miR171d和NtGRAS-R1参与烟草打顶后根部的响应。8.打顶后NtWRKY-R1表达下调,NtPMT表达上调,WRKY转录因子能特异的结合序列为5′-TTGAC-C/T-3′(W-box)的顺式作用元件,而NtPMT的启动子中包含三个W-boxes。推测NtWRKY-R1可能直接通过结合NtPMT的启动子,进而负调控NtPMT的表达。NtWRKY-R1是Nta-miR167d的靶基因,在打顶后NtWRKY-R1的表达下调,而Nta-miR167d的表达上调,表明Nta-miR167d和NtWRKY-R1的表达变化均有助于提高打顶后烟草中烟碱生物合成能力。