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禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV)是一种无囊膜的双股DNA病毒,直径大小为60-90 nm,属于腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒属(Aviadenovirus)。依据限制性内切酶消化模式与血清交叉中和试验的不同,I群禽腺病毒(FAdV-I)又分为5个亚群(A-E)、12个血清型(FAdV-1至11,其中FAdV-8分为a和b两型),可以诱发禽类的多种疾病,包括包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis,IBH)、心包积液综合征(Hydropericardium syndrome,HPS)和肌胃糜烂。关于我国FAdV的感染,1976年台湾首次报道了IBH的发生,随后该病在大陆发生并全国性蔓延,常态化流行,但是多发于肉鸡群,HPS只见散发性流行,其危害并未引起很大的关注。自2014年秋季后,我国HPS的病例逐渐增加,尤其是在山东省的肉杂鸡(817肉鸡)、柴鸡、商品蛋鸡等鸡群迅速蔓延,2015年6月之后,该病在中国大面积的爆发流行,使养禽业遭受了巨大的经济损失。自HPS在山东爆发流行以来我们目前跟踪鸡群中FAdV的感染情况,我们对105个腺病毒感染病例进行了实验室综合诊断、病毒分离鉴定及发病情况调查分析,旨在为阐明FAdV流行规律及防制提供理论依据。将本实验室分离的一株FAdV-4对SPF雏鸡、肝细胞及心肌细胞进行了体内外感染试验,初步揭示了FAdV-4对肝脏和心脏的损伤机制以及心包积液形成的原因。本试验采用PCR和RT-PCR的方法对105例FAdV-I阳性的临床病例进行了网状内皮增生病毒(REV)、马立克氏病毒(MDV)和传染性贫血病毒(CIAV)的检测;并对FAdV分离株的Hexon全基因进行了克隆测序与分析;以及对自然病例进行了详细的剖检和组织病理学观察。结果显示FAdV可以感染多种品系多个日龄阶段的鸡群;FAdV感染情况调查发现,68个鸡群是FAdV-C的感染,5个是FAdV-D,2个是FAdV-E,30个存在两种或三种FAdV的混合感染现象,其中血清4型FAdV(FAdV-4)是感染最多的血清型(93%);FAdV-4分离株的Hexon基因与已发表的FAdV-4基因进行同源性比较发现,本实验分离的毒株与国外分离的毒株在同一分支上,且没有出现较大变异。另外,FAdV感染发病鸡群中还存在免疫抑制病原混合感染的情况,其中CIAV、MDV和REV混合感染的比例分别为50%、33%和16%。HPS病例的剖检病变特征是心包腔大量积液,肝脏变性肿胀及点状出血和坏死;组织病理学特点主要表现是肝细胞变性、坏死及核内包涵体,心肌纤维变性、间质充血水肿;透射电镜可直接观察到肝脏胞核中有晶格状排列的病毒粒子,直径大小为70 nm。为明确FAdV-4 SDDM-4/15分离株的致病性和HPS的发病规律,皮下接种感染SPF雏鸡,观察感染鸡的临床症状、剖检病变、组织病理学变化、器官水肿及肝脏和心脏的功能变化。结果发现,雏鸡在攻毒之后第2 d开始出现轻微的精神沉郁症状,之后6 d持续死亡,死亡率50%,感染组鸡的体重与对照组相比差异显著,死亡鸡只均表现严重出血性肝炎和心包积液病变,心脏、肺脏、肾脏和脾脏发生不同程度的水肿。组织病理学观察发现病变主要见于肝脏和心脏,其病变性质与临床病例相同,胰腺上皮细胞变性坏死、核内嗜碱性包涵体,脾脏、法氏囊、胸腺淋巴细胞均具有一定程度的坏死病变,脑和消化器官也出现一定的病理损伤。检测血清中肝和心功能酶指标发现,攻毒之后第3 d含量显著升高。综上所述,FAdV-4分离毒株对SPF雏鸡有很强的致病性,导致生长缓慢,全身多器官发生病理损伤,以肝脏和心脏的结构及功能损伤最为严重。FAdV-4体内外感染试验表明,该病毒最易感染肝细胞且迅速导致严重的病理变化,除引起肝细胞急性变性坏死和核内包涵体形成外,还引起血清中白蛋白(ALB)和血糖(GLU)浓度的降低,天冬氨酸氨基转移酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)含量上升,与对照组相比差异显著(P<0.05)。TUNEL染色发现,FAdV-4可以诱导肝细胞发生凋亡。通过q-PCR的方法对感染鸡的肝脏和LMH细胞进行了白细胞介素(Il)1b、Il6、Il8和肿瘤坏死因子(Tnf)a mRNA水平检测,结果发现,与对照组相比4种炎症因子的mRNA水平显著升高(P<0.05)。通过western-blot检测发现,FAdV-4感染肝细胞后促进自噬标志蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3-I)向LC3-II的转变,荧光显微镜观察转染GFP-LC3细胞中荧光从弥散状向点状分布转变,证实FAdV-4感染肝细胞后能够诱导自噬体的形成。利用自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)和抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)改变细胞的自噬状态,结果显示细胞内FAdV-4的含量分别上升或下降,说明细胞自噬程度与病毒增殖量呈正相关。FAdV-4体内和体外感染试验结果表明,心包积液的总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶同工酶(CKMB)、乳酸脱氢酶(LDH)、K~+、Na~+、Cl~-和病毒含量与血清相比没有明显差异。雏鸡感染病毒后心组织中4种炎症因子的m RNA的水平在不同时间点均有上调,与对照组比差异显著(P<0.05),但是体外感染试验中细胞的炎症因子m RNA水平并无明显变化,又从蛋白水平验证发现,细胞上清中IL-6、IL-8、TNF-α和心肌酶的含量也没有明显变化。FAdV-4感染心肌细胞后,TUNEL染色结果未发现细胞凋亡现象。由此可见,心包积液主要来自血浆渗出,FAdV-4不能直接诱导心肌细胞发生凋亡。本研究证实目前流行的鸡腺病毒病主要是由FAdV-4感染所致,且存在其他血清型FAdV及高比例免疫抑制病毒的混合感染,FAdV-4感染主要引起以核内包涵体形成为特征的肝细胞变性坏死,并诱发肝细胞凋亡和自噬;但不直接感染心肌细胞,不能直接诱导心肌细胞发生凋亡,心包积液的形成主要缘于血浆渗出,类似的水肿病变也发生于肺、肾等其他器官。