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硫化氢(H2S)是一种有毒的、具有臭鸡蛋气味的气体。在一系列哺乳动物细胞和组织中,主要是由胱硫醚-β-合酶(cystathionine β-synthase, CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)分解L-半胱氨酸和同型半胱氨酸,从而产生内源性H2S。CBS主要存在于中枢神经系统(central nervous system, CNS),而CSE则主要存在于心血管系统。3-巯基丙酮酸硫基转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST)是哺乳动物体内的第三种H2S生成酶,主要分布于脑和血管内皮细胞中,能够与半胱氨酸氨基转移酶(cysteine aminotransferase, CAT)共同将L-半胱氨酸和α-酮戊二酸转化为H2S。近年来,越来越多的证据表明H2S在许多生理与病理进程中发挥着重要作用,如心肌保护、促进血管生成、抗凋亡、舒张血管、抗炎作用等。现已表明,H2S已经成为继一氧化碳(CO)与一氧化氮(NO)之后的第三种气体信号分子。然而H2S作用的具体分子机制,尤其是H2S作用潜在的靶点,目前还研究的很少。超氧化物歧化酶(superoxide dismutases, SODs)是生物体内能够有效清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要酶类,其作用机理是通过催化O2-发生歧化反应,从而生成O2与H2O2,而H2O2又可以在过氧化氢酶的作用下分解为无毒的H2O和O2。Cu/Zn-SOD和Mn-SOD是哺乳动物细胞内的两种SOD,Mn-SOD存在于线粒体基质中,而Cu/Zn-SOD则主要分布于细胞基质、线粒体膜间隙以及细胞核中。铜离子和锌离子是Cu/Zn-SOD中的两种金属离子,它们起着不同的作用,铜离子位于Cu/Zn-SOD的活性中心,与酶的催化作用有关,而锌离子则在维持结构稳定方面起着重要作用。锰离子位于Mn-SOD的活性中心,可以通过一系列氧化还原反应来发挥催化活性。近年来研究发现H2S可以提高心肌细胞中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性,但是具体的作用机制却没有阐明。因此,在本课题中我们主要研究了H2S提高Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性的作用并提出了可能的作用机制。首先,我们构建了新生Sprague-Dawley (SD)大鼠心肌细胞缺氧／复氧模型,检测外源性H2S对心肌细胞凋亡、ROS生成、Cu/Zn-SOD与Mn-SOD活性及其表达等指标的影响。我们发现50μmol/L NaHS可以有效降低缺氧／复氧后心肌细胞的凋亡水平,减少ROS生成,提高Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性,但是对Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的表达却没有明显影响,提示H2S可能是通过改变Cu/ Zn-SOD和Mn-SOD的结构从而提高其活性。此外,当NaHS浓度高于50 μmol/L时,心肌细胞内的凋亡水平和ROS生成量逐渐升高,而Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性则逐渐下降。上述研究表明NaHS在一定的浓度范围内对心肌细胞具有保护作用,而当NaHS浓度高于某个阈值时,其细胞毒性作用就开始显现出来,不利于细胞的正常生长。其次,通过转染Cu/Zn-SOD/Mn-SOD si RNA降低心肌细胞内Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的表达,并构建新生SD大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,检测外源性H2S对Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因敲除以及缺氧/复氧损伤后心肌细胞凋亡、ROS生成、Cu/Zn-SOD与Mn-SOD的活性及相关蛋白表达的影响。结果表明,降低心肌细胞内Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的表达水平,可以使外源性H2S提高Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性的能力减弱。此外,我们还发现心肌细胞内存在着不同的代偿机制,这些代偿机制对于维持细胞内稳态有重要作用。我们又进一步研究了内源性H2S对心肌细胞内凋亡水平、ROS生成、Cu/Zn-SOD与Mn-SOD的活性及相关蛋白表达的影响。心肌细胞转染CSE/CBS/3-MST si RNA 48 小时后进行缺氧／复氧。结果表明,与缺氧／复氧组相比,转染CSE/CBS si RNA细胞中凋亡水平和ROS生成量均显著升高,Cu/Zn-SOD与Mn-SOD蛋白表达无明显变化,但是其活性却明显降低。与缺氧／复氧组相比,转染3-MST siRNA细胞中凋亡水平,ROS生成量,Cu/Zn-SOD与Mn-SOD蛋白表达无统计学差异。表明在SD大鼠心肌细胞中存在三种H2S生成酶,即CSE、CBS和3-MST,它们对于维持细胞内Cu/Zn-SOD与Mn-SOD活性具有不同作用。我们还发现心肌细胞转染CSE si RNA后可以导致CBS和3-MST代偿性升高,转染CBS si RNA后可以导致3-MST代偿性升高,而转染3-MST si RNA后CSE与CBS的表达却没有明显变化,提示它们在心肌细胞内的作用大小顺序为：CSE> CBS> 3-MST。此外,我们还发现外源性H2S可以减轻心肌细胞转染CSE si RNA或CBS si RNA造成的损伤,由此我们可以得出内源性H2S与外源性H2S在保护心肌细胞方面均起着重要作用。最后,我们通过Cu/Zn-SOD与H2S放射性受体-配体结合实验,紫外-可见光谱分析,以及量子化学计算等方法研究了H2S提高Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性的作用机制。结果表明,H2S可能是通过取代Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性中心部位与Cu离子和Mn离子进行弱配位的水,从而提高Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性。此外,我们通过放射性受体-配体结合实验检测了表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)与H2S的结合能力,还构建了CMV启动子以及心肌特异性启动子α-MHC区动的CSE蛋白表达腺病毒,为进一步研究H2S的作用机制建立基础。总之,我们的研究表明H2S可以提高Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性,可能是通过取代位于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性中心部位与铜离子和锰离子进行弱配位的水实现的。我们发现大鼠心肌细胞中存在三种H2S生成酶,即CSE,CBS和3-MST,它们生成H2S的作用大小依次为：CSE>CBS>3-MST。此外,我们还发现大鼠心肌细胞中存在着不同的代偿机制,可能对维持细胞内稳态有重要作用。