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溶菌酶广泛存在于各种动物、植物和微生物中,能够选择性地分解病原微生物细胞壁中的肽聚糖,一直以来被用作一种“模型”体系来研究蛋白质的空间构象和酶动力学等。多细胞动物通过先天免疫和后天免疫的系统来抵御感染性生物体,但昆虫在长期的生物进化过程中已经形成了与脊椎动物不同的独特免疫系统,昆虫中仅存在先天免疫。作为先天免疫的重要成员,各种抗菌多肽在昆虫抵御病原微生物的过程中具有重要作用,其中溶菌酶是最为著名的。目前,昆虫中主要有两类溶菌酶,除了常见的鸡型（c型）溶菌酶外,还存在无脊椎动物型（i型）溶菌酶,但在蛋白质水平上的具有功能特征的大多为c型溶菌酶,而i型溶菌酶仅在DNA或m RNA水平上具有特征。九香虫Coridius chinensis属半翅目Hemiptera兜蝽科Dinidoridae,是我国常用的药用昆虫。研究发现,九香虫的提取物具有广谱的抗菌活性,这主要源于其中的各类抗菌多肽。因此,研究九香虫溶菌酶不仅对九香虫先天免疫机制具有重要意义,也为九香虫药用成分的进一步开发奠定了理论基础。本研究从九香虫转录组数据中筛选并鉴定了一种c型溶菌酶CcLys2（Gen Bank登录号:MN816376）,研究了CcLys2与其它昆虫c型溶菌酶的进化关系,并对CcLys2基因在九香虫体内的表达模式以及CcLys2在细菌感染后表达水平进行了研究,探讨了CcLys2在九香虫生长发育和先天免疫中作用。此外,还利用大肠杆菌BL21（DE3）和毕赤酵母GS115表达系统成功表达CcLys2,对其结构特征及抗菌活性进行了研究。获得了以下结果:1.九香虫溶菌酶CcLys2基因的克隆及特征分析CcLys2来源于九香虫转录组数据,在NCBI数据库中的BLAST结果表明,它是c型溶菌酶基因。通过克隆测序获得CcLys2基因序列1096 bp,其中开放阅读框为672 bp,编码223个氨基酸（AAs）。CcLys2的预测的理论分子量为24.8k Da,等电点p I=5.09。CcLys2的氨基酸序列分为信号肽和成熟肽两部分,N端信号肽包含13 AAs和信号肽裂解位点为A13↓K14),C端成熟肽由210 AAs组成。亚细胞定位分析显示,预测的CcLys2位于细胞外,是一种分泌蛋白。结构域分析表明CcLys2属于c型溶菌酶和α-乳清蛋白家族,有一个保守的c型溶菌酶结构域LYZ1和八个半胱氨酸残基,它们可以形成4对分子内二硫键(C6-C124、C27-C113、C62-C73和C69-C87)。此外,CcLys2还具有胞壁质酶活性必不可少的催化必需残基:谷氨酸E32和天冬氨酸D50。保守结构域和系统发育分析表明CcLys2属于节肢动物c型溶菌酶的一个古老的系统发育类群,即c型溶菌酶的H分支。2.九香虫溶菌酶基因CcLys2的时空表达谱通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,RT-q PCR）检测了九香虫c型溶菌酶CcLys2基因的表达模式,结果显示:CcLys2基因在不同发育阶段的表达存在差异,在2龄若虫最高的表达水平最高,5龄若虫次之,1龄若虫表达量最低。CcLys2在卵、1龄、3龄和4龄若虫中的表达相对较低,且表达水平无显著差异。成虫雄雌虫之间的表达也没有显著差异。此外,在成虫的不同组织中,CcLys2主要在脂肪体表达,其次是血淋巴和中肠,而其他组织中CcLys2的表达水平较低,几乎没有表达。3.九香虫溶菌酶CcLys2的细菌诱导表达将革兰氏阳性菌藤黄微球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌注射到九香虫成虫体内后,CcLys2的表达水平在6～60 h显著上调。显然,CcLys2参与了细菌感染的免疫应答。此外,通过用细菌饲喂九香虫,CcLys2的表达水平在饲喂6 h后显著高于对照组,说明喂食细菌可以诱导CcLys2,并且表明这种酶至少部分在肠道中分泌。4.九香虫溶菌酶CcLys2在大肠杆菌中的表达与活性检测为了让CcLys2在大肠杆菌BL21（DE3）表达系统中得到最理想的表达量。根据大肠杆菌对密码子使用的偏好,利用Gen Smar密码子优化工具（beta1.0）对CcLys2成熟肽的核苷酸序列进行了优化。限制性内切酶识别位点Nde I和Eco R I分别添加在相应基因序列的5’和3’端。将6×His标签添加到氨基酸序列的N端,以利于重组溶菌酶的纯化。合成优化的序列,将其亚克隆到p ET-28b（+）质粒中并转化大肠杆菌后,筛选阳性克隆。将阳性克隆用1 mmol/L IPTG进行诱导,诱导表达产物在纯化后,经SDS-PAGE以及Western blot检测,在约28 k Da处存在特异性条带和印迹。纯化后的CcLys2经透析复性后,显示了胞壁质酶活性,对4种革兰氏阳性菌中的藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌以及无乳链球菌有裂解作用,但对金黄色葡萄球菌无裂解作用。此外对参与测试的4种革兰氏阴性菌也没有观察到CcLys2的任何裂解活性。5.九香虫溶菌酶CcLys2在毕赤酵母中的分泌表达初探目的基因连接到重组质粒上,并进行线性化和磷酸化,然后电转化进入毕赤酵母感受态细胞GS115中,使目的基因CcLys2整合至毕赤酵母基因组。用博来霉素Zeocin筛选阳性克隆并鉴定Mut+表型,并克隆测序验证阳性重组菌株GS115/p PICZαA-CcLys2。阳性重组菌株使用0.5%甲醇诱导,表达产物纯化后经SDS-PAGE以及Western blot检测,在发酵上清中发现了约27 k Da处的特异条带和印迹。与原核表达复性后的CcLys2类似,诱导上清的浓缩物对革兰氏阳性菌具有裂解活性,但在毕赤酵母中的表达量较少,保持活性的前提下纯化相对困难。