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背景和目的：
真菌性角膜炎(Fungal Keratitis, FK)是一种致盲率很高的感染性角膜病，该病的破坏作用不仅在于真菌感染期对角膜组织的破坏，更在于感染控制后愈合期形成的角膜瘢痕也会严重影响患者视力。之前的研究多集中在对真菌的杀伤和消灭，而对于后期角膜瘢痕的形成方面关注较少。角膜移植是治疗角膜瘢痕的有效手段，但是我国的角膜供体来源有限，且存在免疫排斥等问题，仍然有大量的患者无法得到治疗。角膜瘢痕形成的本质是胶原纤维的异常增生、排列紊乱，同时伴有过度生成的细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的堆积和角膜基质细胞(Corneal stromal keratocytes, CSKs)的转化。角膜损伤的同时伴有角膜基质细胞的激活，受损的角膜上皮细胞和激活状态的角膜基质细胞“合作”释放趋化因子，吸引炎症细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)引起炎症反应。此外，角膜基质细胞在转化生长因子β(Transforminggrowthfactor，TGFβ)作用下向肌成纤维细胞转化，参与损伤修复。角膜瘢痕形成归因于损伤修复过程中的细胞纤维化，细胞纤维化能够促进组织修复，却降低角膜透明度，影响视力。控制角膜基质细胞的活化和分化是抑制和预防角膜纤维化的关键。脐带间充质干细胞(Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UC-MSCs)来源于新生儿脐带组织华通氏胶(Wharton’s jelly)，具有多向分化潜能、低免疫原性和免疫调节作用。UC-MSCs在眼表的研究多集中于角膜上皮损伤、角膜移植、干眼等领域，然而关于UC-MSCs对角膜纤维化影响的研究较少。研究发现将UC-MSCs移植入Lumican缺陷小鼠模型的角膜发现角膜透明度和基质层厚度均有明显增加，UC-MSCs在微环境作用下分化为角膜基质细胞并表达硫酸软骨素和蛋白聚糖。关于UC-MSCs对真菌性角膜炎感染控制后愈合期角膜瘢痕形成的影响研究至今尚未见报道。
本研究分为四个部分：
第一部分：人脐带间充质干细胞和人角膜基质细胞分离培养和鉴定
通过组织块培养法分离UC-MSCs和CSKs进行原代培养，通过细胞形态学观察、流式细胞术、细胞免疫荧光等技术手段进行细胞鉴定。培养的原代细胞为后续实验提供实验材料和实践基础。
第二部分：不同浓度TGFβ1对角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化的影响以及脐带间充质干细胞发挥的作用
利用细胞划痕实验、细胞免疫荧光学染色、实时荧光定量PCR等实验技术手段探讨不同浓度TGFβ1对体外培养CSKs损伤后的迁移、分泌蛋白因子、α-SMA的表达和TGFβ1/Smad2信号转导通路的影响，更进一步明确UC-MSCs和CSKs共培养后上述观察指标的变化情况。
第三部分：脐带间充质干细胞对小鼠真菌性角膜炎角膜瘢痕形成的影响
拟通过常见致病菌腐皮镰孢菌建立小鼠真菌性角膜炎模型，在使用抗真菌药物那他霉素滴眼液点眼进行真菌杀灭的基础上，根据分组不同在创伤后1d、4d和7d分别给予UC-MSCs或vehicle结膜下注射。通过眼前段照相观察角膜瘢痕形成面积和角膜浑浊度，通过病理切片及HE染色观察角膜各层组织结构和厚度变化，通过共聚焦显微镜二次谐波功能观察角膜组织胶原结构排列，通过免疫荧光染色观察肌成纤维细胞标记物α-SMA的表达，通过RT-qPCR和ELISA观察α-SMA、TGFβ1、CTGF和Ⅰ型胶原的分子表达水平，同时深入探讨信号传导通路TGFβ1/Smad2在UC-MSCs对真菌性角膜炎角膜瘢痕形成的影响中发挥的作用。
第四部分：脐带间充质干细胞对小鼠真菌性角膜炎后期中性粒细胞和巨噬细胞募集的影响
通过建立小鼠真菌性角膜炎模型，在使用抗真菌药物那他霉素滴眼液点眼进行真菌杀灭的基础上，根据分组不同在创伤后1d、4d和7d分别给予UC-MSCs或vehicle结膜下注射。并于创伤后7d、14d和21d分别对各组小鼠角膜取材进行免疫荧光学染色，在共聚焦显微镜下对小鼠角膜各区域进行层扫和细胞计数，分别统计整个角膜中性粒细胞和巨噬细胞的体积，观察UC-MSCs对小鼠真菌性角膜炎后期中性粒细胞和巨噬细胞募集的影响。
材料和方法：
1．人脐带间充质干细胞和人角膜基质细胞分离培养和鉴定
通过组织块培养法分离培养UC-MSCs和CSKs，通过3～5代的传代和扩增，获取传代稳定、细胞纯度高、扩增效率好的细胞。在倒置显微镜下观察细胞生长状态和细胞形态。使用荧光标记抗体CD29、CD34、CD44和CD45对原代培养UC-MSCs进行流式细胞学鉴定；使用荧光标记抗体Desmin、Vimentin和CK12对原代培养CSKs进行细胞免疫荧光染色鉴定。
2．不同浓度TGFβ1对角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化的影响以及脐带间充质干细胞发挥的作用
使用第一阶段原代培养获取的UC-MSCs和CSKs用于此部分的实验。首先利用Transwell法实现UC-MSCs与CSKs共培养；其次分别建立5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml等不同浓度TGFβ1诱导角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化模型，UC-MSCs与CSKs共培养体系内加入TGFβ1浓度为5ng/ml。进行细胞划痕实验，分别于划痕后0h、24h倒置显微镜下观察、拍照，计算细胞迁移距离；建模后48h获取细胞爬片，进行免疫荧光染色，检测α-SMA、Smad2和磷酸化Smad2蛋白的表达；利用RT-qPCR技术测定细胞内Keratocan、Lumican、Biglycan、Decorin、BMP3、ALDH1A1和ALDH3A1的相对表达量。
3．脐带间充质干细胞对小鼠真菌性角膜炎角膜瘢痕形成的影响
使用8～12周龄的C57BL/6J雄性野生型小鼠，随机分为Control组、FK组、vehicleinjFK组和UC-MSCsinjFK组。进行小鼠真菌性角膜炎模型制作，vehicleinjFK组和UC-MSCsinjFK组分别于建模后1d、4d和7d进行PBS或UC-MSCs结膜下注射。在裂隙灯显微镜下对建模后小鼠进行隔天观察，并在建模后14d、21d、28d进行眼前段拍照及临床角膜病变评分；建模后14d、21d和28d，对各实验组眼球取材进行病理学检测，观察角膜各层组织结构和厚度变化情况；建模后14d，对各实验组小鼠角膜取材进行角膜整铺片α-SMA免疫荧光染色，观察肌成纤维细胞的生成情况；建模后14d、21d和28d，使用双光子共聚焦显微镜二次谐波成像功能对小鼠角膜胶原结构进行活体检测，观察胶原纤维的破坏情况；建模后14d、21d和28d，对小鼠角膜取材，利用RT-qPCR和ELISA技术检测纤维化相关因子α-SMA、TGFβ1、CTGF和Ⅰ型胶原的表达水平；建模后14d，对各组小鼠角膜取材，利用Westen-blot技术检测Smad2和磷酸化Smad2蛋白表达情况，明确TGFβ1/Smad2信号通路在角膜瘢痕形成过程中发挥的作用。
4．脐带间充质干细胞对小鼠真菌性角膜炎后期中性粒细胞和巨噬细胞募集的影响
使用8～12周龄的C57BL/6J雄性野生型小鼠，随机分为FK组、vehicleinjFK组和UC-MSCsinjFK组。小鼠真菌性角膜炎模型制作和UC-MSCs移植等实验方法同第三部分。建模后7d、14d、21d，对各实验组小鼠角膜取材，利用荧光标记抗体Gr-1和F4/80对角膜整铺片行中性粒细胞和巨噬细胞免疫荧光染色。应用单光子共聚焦显微镜对角膜整铺片进行Z轴扫描，扫描范围涵盖角膜中央区、旁中央区、周边区和角膜缘区，以清晰显示中性粒细胞和巨噬细胞在整个角膜的表达。使用Imaris软件对单光子激光共聚焦显微镜层扫图像进行分析，分别统计角膜内中性粒细胞和巨噬细胞的体积(μm3)并进行统计比较。
结果：
1．使用添加10％FBS的DMEM/F12培养基对脐带来源的华通氏胶进行贴壁培养7d后，倒置显微镜下观察发现：有大量细胞从组织块周围游出，细胞形态呈现梭形、多角形、纺锤形。流式细胞仪检测结果显示：细胞膜表面高表达CD29和CD44，低表达CD34和CD45，CD45(-)CD34(-)CD29(+)CD44(+)细胞占有核细胞的96.30％。
2.使用添加10％FBS的DMEM/F12培养基对角膜板层基质进行贴壁培养6d后倒置显微镜下观察发现：有少量星状、短梭形、多角形细胞围绕组织块边缘爬出。对爬出细胞进行消化传代，传代细胞增殖迅速，表现为成纤维样细胞形态，胞体狭长，突触细长。免疫荧光学检测发现：CSKs波形蛋白(Vimentin)、结蛋白(Desmin)呈阳性表达，上皮细胞标记物CK12呈阴性表达。
3.细胞划痕实验结果显示：损伤后24h，CSKs组细胞向划痕区域迁移距离长，迁移范围大，具有较强的细胞迁移能力；而CSKs+5ng/mlTGFβ1组、CSKs+10ng/mlTGFβ1组和CSKs+20ng/mlTGFβ1组均表现出细胞向划痕区域迁移距离短，迁移范围小，划痕区域的细胞密度低于CSKs组；CSKs+UC-MSCs+5ng/mlTGFβ1组细胞迁移距离的平均值低于CSKs组，但高于CSKs+5ng/mlTGFβ1组。
4.TGFβ1显著抑制角膜基质细胞Keratocan、Decorin、ALDH1A1和BMP3的表达；UC-MSCs促进TGFβ1处理后的角膜基质细胞Keratocan和ALDH3A1表达提高；TGFβ1诱导后角膜基质细胞Keratocan、Lumican、Decorin、BMP3和ALDH1A1表达显著下降，且随着TGFβ1浓度的提高，表达进一步受到抑制。
5.α-SMA在CSKs免疫荧光表达弱。经过5ng/mlTGFβ1处理48h后，α-SMA在胞浆内表达增强，细胞形态发生改变，胞体伸长、变细，为典型的肌成纤维样细胞形态改变；而UC-MSCs抑制α-SMA表达，细胞形态改变不明显。
6.Smad2在CSKs胞浆内表达，20ng/mlTGFβ1处理后细胞内Smad2蛋白表达升高，免疫荧光强度增强；CSKs不表达或低表达磷酸化Smad2蛋白，在TGFβ1诱导下，磷酸化Smad2蛋白在胞浆内表达升高，并随着TGFβ1浓度提高，表达强度逐渐增强；CSKs+UC-MSCs+5ng/mlTGFβ1组磷酸化Smad2表达增强，但荧光强度低于CSKs+5ng/mlTGFβ1。
7.真菌性角膜炎模型建立后24h，可见角膜中央病灶形成、角膜水肿、前房积脓；建模后14d，角膜中央区角膜瘢痕形成，呈瓷白色均匀致密浑浊；建模后21d和28d，角膜瘢痕形成面积较前略有缩小，但依然占到角膜总面积的50％以上。UC-MSCs结膜下注射后角膜浑浊度减轻，角膜瘢痕形成面积缩小，角膜透明度增加。对角膜瘢痕形成面积和角膜浑浊度进行计算和评分，差异具有统计学意义。
8.病理结果显示：建模后14d、21d和28d，角膜上皮层增厚，上皮基底细胞迁移变形，角膜基质层正常结构遭到破坏，胶原纤维排列紊乱，出现胶原组织降解，角膜内皮增厚，前房消失，角膜全层有大量炎症细胞浸润。UC-MSCs结膜下移植后，角膜厚度增加减轻，有上皮层或基质层的局限的瘢痕结构形成，炎症细胞浸润减轻，对角膜厚度的统计比较发现与UC-MSCsinjFK组和vehicleinjFK组相比差异具有统计学意义。
9.真菌感染角膜后破坏角膜胶原结构，导致纤维结构排列紊乱。UC-MSCs在眼部的应用能够减轻角膜基质层的胶原破坏，改善纤维层排列紊乱状态，改善角膜透明度。
10.真菌性角膜炎小鼠角膜瘢痕形成区α-SMA表达升高，肌成纤维细胞生成增加；UC-MSCsinjFK组小鼠角膜病灶区同样表现为α-SMA表达增加，但相对表达强度却低于FK组和vehicleinjFK组。
11.真菌性角膜炎小鼠角膜瘢痕形成后，纤维化相关因子α-SMA、TGFβ1、CTGF和Ⅰ型胶原mRNA表达增强；UC-MSCs显著抑制相关因子核酸和蛋白水平的表达，差异具有统计学意义。
12.角膜瘢痕形成过程中，TGFβ1/Smad2信号转导通路被激活，小鼠角膜Smad2和磷酸化Smad2蛋白表达水平升高；UC-MSCsinjFK组小鼠角膜Smad2磷酸化水平受到抑制，与vehicleinjFK组相比，差异具有统计学意义。
13.中性粒细胞和巨噬细胞在真菌性角膜炎建模后7d、14d和21d在角膜募集增加，表现为从角膜缘趋化至中央病灶区，角膜缘和病灶区细胞分布密度高，其他区域细胞分布密度低的特点；UC-MSCsinjFK组小鼠角膜同样观察到中性粒细胞和巨噬细胞募集加强的现象，但通过对细胞体积的计算，UC-MSCsinjFK组小鼠角膜细胞募集总数低于对照组，差异具有统计学意义。
结论：
1.本次实验通过组织块培养法成功分离出人脐带间充质干细胞和人角膜基质细胞，并对分离出的细胞进行扩增和鉴定。研究发现体外培养UC-MSCs细胞形态呈现梭形、多角形、纺锤形等，放射状或漩涡状生长。细胞膜表面高表达CD29和CD44，低表达造血干细胞表型CD34和CD45。人角膜基质细胞能够成功从角膜板层基质分离，分离出的初代细胞表现为星状、短梭状、多角形，随着传代次数增加，细胞形态逐渐变化为长梭状，伴有细长的细胞突触，以加强细胞间连接和交流。CSKs高表达波形蛋白(Vimentin)，低表达上皮细胞标志因子CK12。同时，结蛋白(Desmin)在CSKs中也呈阳性表达。
2.较高浓度TGFβ1抑制体外培养CSKs损伤后迁移，下调CSKs特定分泌蛋白Keratocan、Lumican、Biglycan、Decorin、BMP3、ALDH1A1和ALDH3A1的表达，提高α-SMA的表达，促进TGFβ1/Smad2信号通路激活，并且随着TGFβ1浓度提高，作用愈加显著。
3.在5ng/mlTGFβ1作用下，UC-MSCs促进CSKs损伤后细胞迁移，提高CSKs分泌蛋白Keratocan、Lumican和ALDH3A1的表达，降低α-SMA的表达，抑制Smad2蛋白磷酸化从而发挥抑制CSKs向角膜肌成纤维细胞转化的作用。
4.真菌感染角膜后，在损伤后24h即可引起角膜浑浊水肿、角膜病灶形成和前房积脓等典型真菌性角膜炎病变特点。感染后3～7天为病变进展高峰期，易发生角膜穿孔、眼内炎等并发症。感染7d后角膜组织逐渐进入修复期，损伤后14d角膜瘢痕形成，病灶区呈现瓷白色致密均匀状角膜瘢痕形成，角膜瘢痕形成面积至少占到角膜总面积的50％以上。真菌性角膜炎感染控制后愈合期除角膜瘢痕形成外，还伴有角膜厚度的增加、胶原组织结构破坏。通过对α-SMA进行免疫荧光染色观察发现，角膜内肌成纤维细胞生成增加。与对照组相比，角膜内瘢痕形成相关因子α-SMA、TGFβ1、CTGF和Ⅰ型胶原的分子表达增强，差异具有统计学意义。TGFβ1/Smad2信号传导通路在角膜瘢痕形成过程中被激活，磷酸化活动加强。
5.人脐带间充质干细胞早期应用于真菌性角膜炎小鼠角膜，在感染控制后愈合期能够有效减轻角膜瘢痕形成，减小瘢痕形成面积，减轻角膜浑浊；改善角膜厚度增加，降低炎症细胞浸润；减轻胶原纤维破坏，重塑角膜；降低瘢痕形成相关因子α-SMA、TGFβ1、Ⅰ型胶原和CTGF的表达，改善角膜纤维化状态；抑制Smad2蛋白磷酸化，调节TGFβ1/Smad2信号传导通路的激活。以上实验结果充分证实脐带间充质干细胞在真菌性角膜炎后期角膜瘢痕形成过程中能够改善角膜浑浊，发挥抗炎、抗纤维化的作用。
6.我们的研究证实：真菌感染角膜后，角膜内中性粒细胞和巨噬细胞的浸润增加。中性粒细胞由角膜缘趋化至病灶区，感染高峰期布满整个角膜，而后细胞浸润数量显著下降；巨噬细胞在小鼠角膜缘募集，向角膜中央病灶部位趋化，表现为角膜缘和病灶区细胞分布密度高，其他区域细胞分布密度低的特点。感染控制后愈合期角膜瘢痕形成时，巨噬细胞在角膜瘢痕形成区持续表达，角膜缘的细胞分布密度降低。UC-MSCs局部应用不改变中性粒细胞和巨噬细胞在真菌性角膜炎小鼠角膜分布的特点，只降低细胞分布的密度和体积，具有减轻中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，抑制炎症反应的作用。
真菌性角膜炎(Fungal Keratitis, FK)是一种致盲率很高的感染性角膜病，该病的破坏作用不仅在于真菌感染期对角膜组织的破坏，更在于感染控制后愈合期形成的角膜瘢痕也会严重影响患者视力。之前的研究多集中在对真菌的杀伤和消灭，而对于后期角膜瘢痕的形成方面关注较少。角膜移植是治疗角膜瘢痕的有效手段，但是我国的角膜供体来源有限，且存在免疫排斥等问题，仍然有大量的患者无法得到治疗。角膜瘢痕形成的本质是胶原纤维的异常增生、排列紊乱，同时伴有过度生成的细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的堆积和角膜基质细胞(Corneal stromal keratocytes, CSKs)的转化。角膜损伤的同时伴有角膜基质细胞的激活，受损的角膜上皮细胞和激活状态的角膜基质细胞“合作”释放趋化因子，吸引炎症细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)引起炎症反应。此外，角膜基质细胞在转化生长因子β(Transforminggrowthfactor，TGFβ)作用下向肌成纤维细胞转化，参与损伤修复。角膜瘢痕形成归因于损伤修复过程中的细胞纤维化，细胞纤维化能够促进组织修复，却降低角膜透明度，影响视力。控制角膜基质细胞的活化和分化是抑制和预防角膜纤维化的关键。脐带间充质干细胞(Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UC-MSCs)来源于新生儿脐带组织华通氏胶(Wharton’s jelly)，具有多向分化潜能、低免疫原性和免疫调节作用。UC-MSCs在眼表的研究多集中于角膜上皮损伤、角膜移植、干眼等领域，然而关于UC-MSCs对角膜纤维化影响的研究较少。研究发现将UC-MSCs移植入Lumican缺陷小鼠模型的角膜发现角膜透明度和基质层厚度均有明显增加，UC-MSCs在微环境作用下分化为角膜基质细胞并表达硫酸软骨素和蛋白聚糖。关于UC-MSCs对真菌性角膜炎感染控制后愈合期角膜瘢痕形成的影响研究至今尚未见报道。
本研究分为四个部分：
第一部分：人脐带间充质干细胞和人角膜基质细胞分离培养和鉴定
通过组织块培养法分离UC-MSCs和CSKs进行原代培养，通过细胞形态学观察、流式细胞术、细胞免疫荧光等技术手段进行细胞鉴定。培养的原代细胞为后续实验提供实验材料和实践基础。
第二部分：不同浓度TGFβ1对角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化的影响以及脐带间充质干细胞发挥的作用
利用细胞划痕实验、细胞免疫荧光学染色、实时荧光定量PCR等实验技术手段探讨不同浓度TGFβ1对体外培养CSKs损伤后的迁移、分泌蛋白因子、α-SMA的表达和TGFβ1/Smad2信号转导通路的影响，更进一步明确UC-MSCs和CSKs共培养后上述观察指标的变化情况。
第三部分：脐带间充质干细胞对小鼠真菌性角膜炎角膜瘢痕形成的影响
拟通过常见致病菌腐皮镰孢菌建立小鼠真菌性角膜炎模型，在使用抗真菌药物那他霉素滴眼液点眼进行真菌杀灭的基础上，根据分组不同在创伤后1d、4d和7d分别给予UC-MSCs或vehicle结膜下注射。通过眼前段照相观察角膜瘢痕形成面积和角膜浑浊度，通过病理切片及HE染色观察角膜各层组织结构和厚度变化，通过共聚焦显微镜二次谐波功能观察角膜组织胶原结构排列，通过免疫荧光染色观察肌成纤维细胞标记物α-SMA的表达，通过RT-qPCR和ELISA观察α-SMA、TGFβ1、CTGF和Ⅰ型胶原的分子表达水平，同时深入探讨信号传导通路TGFβ1/Smad2在UC-MSCs对真菌性角膜炎角膜瘢痕形成的影响中发挥的作用。
第四部分：脐带间充质干细胞对小鼠真菌性角膜炎后期中性粒细胞和巨噬细胞募集的影响
通过建立小鼠真菌性角膜炎模型，在使用抗真菌药物那他霉素滴眼液点眼进行真菌杀灭的基础上，根据分组不同在创伤后1d、4d和7d分别给予UC-MSCs或vehicle结膜下注射。并于创伤后7d、14d和21d分别对各组小鼠角膜取材进行免疫荧光学染色，在共聚焦显微镜下对小鼠角膜各区域进行层扫和细胞计数，分别统计整个角膜中性粒细胞和巨噬细胞的体积，观察UC-MSCs对小鼠真菌性角膜炎后期中性粒细胞和巨噬细胞募集的影响。
材料和方法：
1．人脐带间充质干细胞和人角膜基质细胞分离培养和鉴定
通过组织块培养法分离培养UC-MSCs和CSKs，通过3～5代的传代和扩增，获取传代稳定、细胞纯度高、扩增效率好的细胞。在倒置显微镜下观察细胞生长状态和细胞形态。使用荧光标记抗体CD29、CD34、CD44和CD45对原代培养UC-MSCs进行流式细胞学鉴定；使用荧光标记抗体Desmin、Vimentin和CK12对原代培养CSKs进行细胞免疫荧光染色鉴定。
2．不同浓度TGFβ1对角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化的影响以及脐带间充质干细胞发挥的作用
使用第一阶段原代培养获取的UC-MSCs和CSKs用于此部分的实验。首先利用Transwell法实现UC-MSCs与CSKs共培养；其次分别建立5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml等不同浓度TGFβ1诱导角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化模型，UC-MSCs与CSKs共培养体系内加入TGFβ1浓度为5ng/ml。进行细胞划痕实验，分别于划痕后0h、24h倒置显微镜下观察、拍照，计算细胞迁移距离；建模后48h获取细胞爬片，进行免疫荧光染色，检测α-SMA、Smad2和磷酸化Smad2蛋白的表达；利用RT-qPCR技术测定细胞内Keratocan、Lumican、Biglycan、Decorin、BMP3、ALDH1A1和ALDH3A1的相对表达量。
3．脐带间充质干细胞对小鼠真菌性角膜炎角膜瘢痕形成的影响
使用8～12周龄的C57BL/6J雄性野生型小鼠，随机分为Control组、FK组、vehicleinjFK组和UC-MSCsinjFK组。进行小鼠真菌性角膜炎模型制作，vehicleinjFK组和UC-MSCsinjFK组分别于建模后1d、4d和7d进行PBS或UC-MSCs结膜下注射。在裂隙灯显微镜下对建模后小鼠进行隔天观察，并在建模后14d、21d、28d进行眼前段拍照及临床角膜病变评分；建模后14d、21d和28d，对各实验组眼球取材进行病理学检测，观察角膜各层组织结构和厚度变化情况；建模后14d，对各实验组小鼠角膜取材进行角膜整铺片α-SMA免疫荧光染色，观察肌成纤维细胞的生成情况；建模后14d、21d和28d，使用双光子共聚焦显微镜二次谐波成像功能对小鼠角膜胶原结构进行活体检测，观察胶原纤维的破坏情况；建模后14d、21d和28d，对小鼠角膜取材，利用RT-qPCR和ELISA技术检测纤维化相关因子α-SMA、TGFβ1、CTGF和Ⅰ型胶原的表达水平；建模后14d，对各组小鼠角膜取材，利用Westen-blot技术检测Smad2和磷酸化Smad2蛋白表达情况，明确TGFβ1/Smad2信号通路在角膜瘢痕形成过程中发挥的作用。
4．脐带间充质干细胞对小鼠真菌性角膜炎后期中性粒细胞和巨噬细胞募集的影响
使用8～12周龄的C57BL/6J雄性野生型小鼠，随机分为FK组、vehicleinjFK组和UC-MSCsinjFK组。小鼠真菌性角膜炎模型制作和UC-MSCs移植等实验方法同第三部分。建模后7d、14d、21d，对各实验组小鼠角膜取材，利用荧光标记抗体Gr-1和F4/80对角膜整铺片行中性粒细胞和巨噬细胞免疫荧光染色。应用单光子共聚焦显微镜对角膜整铺片进行Z轴扫描，扫描范围涵盖角膜中央区、旁中央区、周边区和角膜缘区，以清晰显示中性粒细胞和巨噬细胞在整个角膜的表达。使用Imaris软件对单光子激光共聚焦显微镜层扫图像进行分析，分别统计角膜内中性粒细胞和巨噬细胞的体积(μm3)并进行统计比较。
结果：
1．使用添加10％FBS的DMEM/F12培养基对脐带来源的华通氏胶进行贴壁培养7d后，倒置显微镜下观察发现：有大量细胞从组织块周围游出，细胞形态呈现梭形、多角形、纺锤形。流式细胞仪检测结果显示：细胞膜表面高表达CD29和CD44，低表达CD34和CD45，CD45(-)CD34(-)CD29(+)CD44(+)细胞占有核细胞的96.30％。
2.使用添加10％FBS的DMEM/F12培养基对角膜板层基质进行贴壁培养6d后倒置显微镜下观察发现：有少量星状、短梭形、多角形细胞围绕组织块边缘爬出。对爬出细胞进行消化传代，传代细胞增殖迅速，表现为成纤维样细胞形态，胞体狭长，突触细长。免疫荧光学检测发现：CSKs波形蛋白(Vimentin)、结蛋白(Desmin)呈阳性表达，上皮细胞标记物CK12呈阴性表达。
3.细胞划痕实验结果显示：损伤后24h，CSKs组细胞向划痕区域迁移距离长，迁移范围大，具有较强的细胞迁移能力；而CSKs+5ng/mlTGFβ1组、CSKs+10ng/mlTGFβ1组和CSKs+20ng/mlTGFβ1组均表现出细胞向划痕区域迁移距离短，迁移范围小，划痕区域的细胞密度低于CSKs组；CSKs+UC-MSCs+5ng/mlTGFβ1组细胞迁移距离的平均值低于CSKs组，但高于CSKs+5ng/mlTGFβ1组。
4.TGFβ1显著抑制角膜基质细胞Keratocan、Decorin、ALDH1A1和BMP3的表达；UC-MSCs促进TGFβ1处理后的角膜基质细胞Keratocan和ALDH3A1表达提高；TGFβ1诱导后角膜基质细胞Keratocan、Lumican、Decorin、BMP3和ALDH1A1表达显著下降，且随着TGFβ1浓度的提高，表达进一步受到抑制。
5.α-SMA在CSKs免疫荧光表达弱。经过5ng/mlTGFβ1处理48h后，α-SMA在胞浆内表达增强，细胞形态发生改变，胞体伸长、变细，为典型的肌成纤维样细胞形态改变；而UC-MSCs抑制α-SMA表达，细胞形态改变不明显。
6.Smad2在CSKs胞浆内表达，20ng/mlTGFβ1处理后细胞内Smad2蛋白表达升高，免疫荧光强度增强；CSKs不表达或低表达磷酸化Smad2蛋白，在TGFβ1诱导下，磷酸化Smad2蛋白在胞浆内表达升高，并随着TGFβ1浓度提高，表达强度逐渐增强；CSKs+UC-MSCs+5ng/mlTGFβ1组磷酸化Smad2表达增强，但荧光强度低于CSKs+5ng/mlTGFβ1。
7.真菌性角膜炎模型建立后24h，可见角膜中央病灶形成、角膜水肿、前房积脓；建模后14d，角膜中央区角膜瘢痕形成，呈瓷白色均匀致密浑浊；建模后21d和28d，角膜瘢痕形成面积较前略有缩小，但依然占到角膜总面积的50％以上。UC-MSCs结膜下注射后角膜浑浊度减轻，角膜瘢痕形成面积缩小，角膜透明度增加。对角膜瘢痕形成面积和角膜浑浊度进行计算和评分，差异具有统计学意义。
8.病理结果显示：建模后14d、21d和28d，角膜上皮层增厚，上皮基底细胞迁移变形，角膜基质层正常结构遭到破坏，胶原纤维排列紊乱，出现胶原组织降解，角膜内皮增厚，前房消失，角膜全层有大量炎症细胞浸润。UC-MSCs结膜下移植后，角膜厚度增加减轻，有上皮层或基质层的局限的瘢痕结构形成，炎症细胞浸润减轻，对角膜厚度的统计比较发现与UC-MSCsinjFK组和vehicleinjFK组相比差异具有统计学意义。
9.真菌感染角膜后破坏角膜胶原结构，导致纤维结构排列紊乱。UC-MSCs在眼部的应用能够减轻角膜基质层的胶原破坏，改善纤维层排列紊乱状态，改善角膜透明度。
10.真菌性角膜炎小鼠角膜瘢痕形成区α-SMA表达升高，肌成纤维细胞生成增加；UC-MSCsinjFK组小鼠角膜病灶区同样表现为α-SMA表达增加，但相对表达强度却低于FK组和vehicleinjFK组。
11.真菌性角膜炎小鼠角膜瘢痕形成后，纤维化相关因子α-SMA、TGFβ1、CTGF和Ⅰ型胶原mRNA表达增强；UC-MSCs显著抑制相关因子核酸和蛋白水平的表达，差异具有统计学意义。
12.角膜瘢痕形成过程中，TGFβ1/Smad2信号转导通路被激活，小鼠角膜Smad2和磷酸化Smad2蛋白表达水平升高；UC-MSCsinjFK组小鼠角膜Smad2磷酸化水平受到抑制，与vehicleinjFK组相比，差异具有统计学意义。
13.中性粒细胞和巨噬细胞在真菌性角膜炎建模后7d、14d和21d在角膜募集增加，表现为从角膜缘趋化至中央病灶区，角膜缘和病灶区细胞分布密度高，其他区域细胞分布密度低的特点；UC-MSCsinjFK组小鼠角膜同样观察到中性粒细胞和巨噬细胞募集加强的现象，但通过对细胞体积的计算，UC-MSCsinjFK组小鼠角膜细胞募集总数低于对照组，差异具有统计学意义。
结论：
1.本次实验通过组织块培养法成功分离出人脐带间充质干细胞和人角膜基质细胞，并对分离出的细胞进行扩增和鉴定。研究发现体外培养UC-MSCs细胞形态呈现梭形、多角形、纺锤形等，放射状或漩涡状生长。细胞膜表面高表达CD29和CD44，低表达造血干细胞表型CD34和CD45。人角膜基质细胞能够成功从角膜板层基质分离，分离出的初代细胞表现为星状、短梭状、多角形，随着传代次数增加，细胞形态逐渐变化为长梭状，伴有细长的细胞突触，以加强细胞间连接和交流。CSKs高表达波形蛋白(Vimentin)，低表达上皮细胞标志因子CK12。同时，结蛋白(Desmin)在CSKs中也呈阳性表达。
2.较高浓度TGFβ1抑制体外培养CSKs损伤后迁移，下调CSKs特定分泌蛋白Keratocan、Lumican、Biglycan、Decorin、BMP3、ALDH1A1和ALDH3A1的表达，提高α-SMA的表达，促进TGFβ1/Smad2信号通路激活，并且随着TGFβ1浓度提高，作用愈加显著。
3.在5ng/mlTGFβ1作用下，UC-MSCs促进CSKs损伤后细胞迁移，提高CSKs分泌蛋白Keratocan、Lumican和ALDH3A1的表达，降低α-SMA的表达，抑制Smad2蛋白磷酸化从而发挥抑制CSKs向角膜肌成纤维细胞转化的作用。
4.真菌感染角膜后，在损伤后24h即可引起角膜浑浊水肿、角膜病灶形成和前房积脓等典型真菌性角膜炎病变特点。感染后3～7天为病变进展高峰期，易发生角膜穿孔、眼内炎等并发症。感染7d后角膜组织逐渐进入修复期，损伤后14d角膜瘢痕形成，病灶区呈现瓷白色致密均匀状角膜瘢痕形成，角膜瘢痕形成面积至少占到角膜总面积的50％以上。真菌性角膜炎感染控制后愈合期除角膜瘢痕形成外，还伴有角膜厚度的增加、胶原组织结构破坏。通过对α-SMA进行免疫荧光染色观察发现，角膜内肌成纤维细胞生成增加。与对照组相比，角膜内瘢痕形成相关因子α-SMA、TGFβ1、CTGF和Ⅰ型胶原的分子表达增强，差异具有统计学意义。TGFβ1/Smad2信号传导通路在角膜瘢痕形成过程中被激活，磷酸化活动加强。
5.人脐带间充质干细胞早期应用于真菌性角膜炎小鼠角膜，在感染控制后愈合期能够有效减轻角膜瘢痕形成，减小瘢痕形成面积，减轻角膜浑浊；改善角膜厚度增加，降低炎症细胞浸润；减轻胶原纤维破坏，重塑角膜；降低瘢痕形成相关因子α-SMA、TGFβ1、Ⅰ型胶原和CTGF的表达，改善角膜纤维化状态；抑制Smad2蛋白磷酸化，调节TGFβ1/Smad2信号传导通路的激活。以上实验结果充分证实脐带间充质干细胞在真菌性角膜炎后期角膜瘢痕形成过程中能够改善角膜浑浊，发挥抗炎、抗纤维化的作用。
6.我们的研究证实：真菌感染角膜后，角膜内中性粒细胞和巨噬细胞的浸润增加。中性粒细胞由角膜缘趋化至病灶区，感染高峰期布满整个角膜，而后细胞浸润数量显著下降；巨噬细胞在小鼠角膜缘募集，向角膜中央病灶部位趋化，表现为角膜缘和病灶区细胞分布密度高，其他区域细胞分布密度低的特点。感染控制后愈合期角膜瘢痕形成时，巨噬细胞在角膜瘢痕形成区持续表达，角膜缘的细胞分布密度降低。UC-MSCs局部应用不改变中性粒细胞和巨噬细胞在真菌性角膜炎小鼠角膜分布的特点，只降低细胞分布的密度和体积，具有减轻中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，抑制炎症反应的作用。