近些年来,心肺复苏的成功率逐渐提高,但由于神经细胞对缺血缺氧敏感而且不能再生,大部分患者复苏后出现不可逆的神经损伤,导致失语、偏瘫、植物人等后遗症甚至导致死亡。尽管采取了亚低温治疗、药物治疗等综合措施治疗心搏骤停后的神经损伤,但是心搏骤停患者的出院生存率仍不高,在中国心搏骤停患者神经功能良好的出院率仅1%左右。如何减轻神经损伤、促进神经修复已成为现代医学的难题,在此我们尝试一种新措施治疗心搏骤停引起的神经损伤。间充质干细胞具有高度自我更新能力,可以多次传代、大量扩增;同时还具有多向分化潜能,在一定的诱导条件下能分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等。ADSCs是来源于脂肪组织的MSCs,其储备丰富,取材容易,其增殖分化能力高度稳定,不会随供者年龄产生变化。目前研究发现ADSCs在小动物脑梗塞模型中取得了良好效果,ADSCs移植能减少脑梗面积,减轻局灶性神经损伤,改善神经功能预后。而脑梗塞为局部性病灶,与心搏骤停引起的全脑范围的缺氧性脑病,在病因、病理机制、临床表现上都有所不同,ADSCs对于心搏骤停引起的全脑范围的缺氧性脑病的治疗效果及治疗机制需要进一步验证。本实验研究异种移植ADSCs对心搏骤停后缺氧性脑病的治疗效果,并探讨其作用机制,为临床治疗提供理论支持。主要内容包括:人ADSCs的培养,从细胞形态、细胞表型、多向分化能力等方面进行鉴定;采用窒息法建立大鼠心肺复苏模型并移植人ADSCs,观察ADSCs对心搏骤停后缺氧性脑病的治疗效果,海马组织内BDNF、IL-6的表达情况。第一部分ADSCs培养及鉴定研究目的从人脂肪组织中分离、培养ADSCs,并从细胞形态、细胞表型、分化能力(成骨分化、成软骨分化、成脂肪分化)等方面进行鉴定,为下一步动物实验奠定基础。材料和方法从健康供者腹部抽取脂肪组织,消化、分离出血管基质部分,在37℃、5%CO2培养箱中使用DMEM/F12+10%胎牛血清培养基中贴壁培养,逐渐纯化为ADSCs,每3天换液1次,待细胞70%~90%融合时进行传代,培养过程中观察细胞形态。取第3代ADSCs采用流式细胞术检测细胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR的表达情况。使用成骨分化试剂盒诱导成骨分化,第28天茜素红染色法、磷酸苯二钠基质(NBT/BCIP)染色法检测成骨分化情况;使用成软骨分化试剂盒诱导成软骨分化,第7天阿利辛蓝染色检测成软骨分化情况;使用成脂分化试剂盒诱导成脂分化,第21天油红O染色法检测成脂分化情况。结果原代培养24小时后,镜下可见短梭形、三角形等多种形态的贴壁细胞,随着时间增长,梭形细胞逐渐增多,呈长梭形外观,细胞成集落样生长,在6~8天后达到80%左右融合。传代后始终保持着稳定的增殖速度。adscs表面抗原cd73、cd90、cd105阳性表达率高,分别为99.99%、99.99%、96.88%,同时阴性表达cd34、cd45、cd11b、cd19、hla-dr。成骨诱导后细胞生长旺盛,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,7天后可见结节样结构,28天后矿化结节形成明显,矿化结节被茜素红染色法染成红色结节,胞质因含有碱性磷酸被nbt/bcip染色法染成深蓝色。成软骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐回缩变圆,7天后用阿利辛蓝染色检测软骨细胞基质中糖胺多糖合成情况,胞质被染成蓝色。成脂诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为圆形,胞浆内可见小脂滴,脂滴数量逐渐增加并相互融合,14天后油红o染色可见细胞内脂滴被染成红色。结论从人脂肪组织中分离并培养出稳定的adscs,从细胞形态、细胞表面抗原、多向分化能力3个方面对细胞进行鉴定,符合mscs的鉴定标准。第二部分观察adscs移植对心肺复苏后缺氧性脑病的治疗效果及保护机制研究研究目的观察异种adscs移植对大鼠心搏骤停后神经功能、神经元凋亡、血清s100β的影响,海马组织bdnf、il-6的表达情况材料和方法54只大鼠随机分为3组(sham组、ca组、adscs组),每组18只。sham组只进行外科操作,不进行心搏骤停及心肺复苏操作。ca组使用气管夹闭法诱导窒息性心搏骤停模型,心搏停止6分钟,复苏后1小时静脉注射1mlpbs。adscs组建立窒息性心搏骤停模型,心搏停止6分钟,复苏后1小时静脉注射人adscs1ml(细胞计数5×106)。操作完成后24小时、72小时、168小时,每组随机选取6只大鼠进行检测。使用神经功能缺损评分评价神经功能,elisa法检测血清s100β浓度,he染色观察海马组织病理变化,tunel染色检测海马神经元凋亡率,werstern-blot检测海马bdnf、il-6蛋白水平。结果1.心搏骤停前采集到的大鼠体重、平均动脉压、心率,比较差异无统计学意义(p>0.05),心肺复苏期间窒息时间、按压时间及复苏后1小时map比较差异无统计学意义(p>0.05)。2.神经功能缺损评分在24小时、72小时、168小时,sham组大鼠评分高于adscs组和ca组,差异具有统计学意义(p<0.05),adscs组均高于ca组,差异具有统计学意义(p<0.05)。3.病理变化sham组大鼠结果正常。CA组大鼠海马区锥体细胞减少,锥体细胞稀疏,大量小胶质细胞增生。ADSCs组大鼠海马区少量细胞核皱缩改变,锥体细胞排列基本正常。4.TUNEL染色在3个时间点,sham组神经元凋亡率明显低于CA组和ADSCs组,差异具有统计学意义(P<0.05),而ADSCs组神经元凋亡率均低于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.血清S100β浓度在3个时间点,sham组血清S100β浓度均低于CA组和ADSCs组差异具有统计学意义(P<0.01),而ADSCs组S100β浓度低于CA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.海马IL-6在3个时间点,sham组IL-6表达水平低于CA组和ADSCs组,差异具有统计学意义(P<0.01)。在24小时、72小时,ADSCs组IL-6高于CA组,差异具有统计学意义(P<0.01)。复苏后168小时,ADSCs组和CA组IL-6比较差异无统计学意义(P>0.05)。7.海马BDNF在复苏后24小时和72小时,ADSCs组和CA组BDNF蛋白水平高于sham组(P<0.01),而ADSCs组BDNF蛋白高于CA组,差异具有统计学意义(P<0.01)。在复苏后168小时,3组BDNF蛋白表达强度接近,差异无统计学意义(P>0.05)。结论心搏骤停能引起神经凋亡、神经功能障碍,ADSCs具有神经保护作用,能抑制神经细胞凋亡,改善神经功能预后。ADSCs可能是通过上调BDNF、IL-6表达发挥神经保护作用。