研究背景临床试验中已经证实，应用非选择性毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChR）抑制剂阿托品能够有效地延缓近视的进展。另一种非选择性mAChR—oxyphenonium，也能够抑制小鸡的形觉剥夺性近视（FDM）。目前为止，已经确定mAChR有五种不同的亚型（M1～M5）。对选择性的mAChR抑制剂的研究表明，哌仑西平（选择性M1受体抑制剂）、喜巴辛（选择性M2／M4受体抑制剂）在两种动物模型中（小鸡及树鼠）均能够通过抑制眼球伸长从而延缓近视进展。但是，它们的作用机制目前仍不明了。阿托品、哌仑西平及喜巴辛通过玻璃体注射时均能抑制FDM，因此最初认为他们是通过结合视网膜上的mAChR而发挥作用的。然而，对小鸡视网膜及猴视皮质的研究表明M1和M4的密度及亲和力在FDM组及对照组间均无差异。此外，破坏视网膜上的mAChR及胆碱能无长突细胞均不能抑制眼球的轴性增长。在脉络膜上的研究也表明mAChR在正常眼和近视进展眼上的表达没有差异。因此，巩膜就被合理地推测为mAChR抑制剂的潜在作用位点。事实上，体外研究已表明阿托品对巩膜细胞具有直接抑制作用；近期的一项研究也表明所有的mAChR亚型（M1～M5），从mRNA及蛋白水平上在人类巩膜上均有表达。但是，目前对视觉调控眼球生长眼上mAChR的表达是否发生变化的研究还未见发表。血管活性肠肽（VIP）作为一种神经肽递质，广泛分布于全身各器官组织中，发挥广泛而重要的信息传递和生理调控功能。已有研究表明，灵长类动物FDM模型中视网膜内丛状层的无长突细胞亚型中VIP的表达明显上调；近期的基因水平上的研究也证实了这种结果。目前的观点认为，异常的视觉输入导致了一类无长突细胞释放VIP增加，VIP这种多肽反过来刺激了视网膜周边前体细胞的增殖，从而引起视网膜生长，促进眼球增长。这种观点需要在FDM模型中从不同水平进行验证。目的研究豚鼠FDM模型中mAChR在视网膜及巩膜上的表达、VIP在视网膜上的表达，以探讨它们在近视形成中的作用。材料与方法1、实验动物与形觉剥夺近视模型的建立：选择30只健康豚鼠，年龄12～14天，体重66～112g，随机分为实验组（n=15）和对照组（n=15），在“12小时亮／12小时暗”的光线环境下饲养。实验组豚鼠随机选择一眼进行形觉剥夺，另一眼开放；对照组豚鼠双眼开放。形觉剥夺时限为14天，处于豚鼠的正视化期。形觉剥夺的建立：制作直径为2cm的黑色橡胶环及橡胶片各15个固定于处理组豚鼠单眼周围皮肤，建立形觉剥夺。屈光度的测量：所有实验动物在实验前后均进行屈光度测量。检查前1小时双眼结膜囊内滴0.5％托比卡胺6次，每10分钟1次。在暗室内由同一验光师用带状光检影镜分别进行水平和垂直径线上的检影验光，屈光度以等效球镜值（球镜值+1／2柱镜值）表示，梯度为0.25D。眼轴长度的测量：所有实验动物在实验前后均进行眼轴长度测量。结膜囊内滴0.5％地卡因2次，同一操作者用A型超声以手动模式测量眼轴长度，连续测量5次，取平均值。眼轴长度定义为在眼轴上从角膜前表面至视网膜前表面的距离。2、组织收集形觉剥夺结束后，过量麻醉法（2％戊巴比妥钠）处死动物。摘除眼球，去除结膜、筋膜、眼外肌等组织，用剪刀沿锯齿缘部环形剪开眼球壁，去除眼前节组织与玻璃体，浸泡于充分的Ames液中。将眼杯剪为两半，在液态（BBS液）无菌环境下剥离视网膜神经上皮，刮除并清洗附着在巩膜上的色素上皮及脉络膜。将视网膜神经上皮及巩膜组织分别处理。用于HE染色及免疫组织化学检测的组织固定于眼球专用固定液（每100ml含40％甲醛10ml、冰醋酸5ml、95％酒精50ml、蒸馏水35ml）中：用于Western印记的组织立即提取组织蛋白，放入-80℃低温冰箱保存；用于RT-RealtimeRCR检测的组织立即提取总RNA，放入-20℃冰箱保存。3、实时定量RT-PCR检测M1～M4应用Trizol法提取视网膜及巩膜中的总RNA，操作步骤按照说明书执行。用DNA酶对提取的总RNA进行处理以消除内源性DNA污染。应用M-MLV试剂盒在37℃1小时条件下将RNA逆转录为cDNA，然后应用实时定量PCR仪进行扩增。SYBR Green 1试剂盒用于检测M1～M4及VIP在mRNA水平上的扩增及检测。定量值从循环域值（荧光第一次显著增长的时间点）获得。管家基因β-actin作为定量RNA的内参照。目的条带的大小通过琼脂糖凝胶电泳确认。数据分析应用2^-ΔCT法。4、免疫组织化学标本以眼球专用固定液浸泡固定、石蜡包埋，切片厚度5μm；将组织切片梯度脱蜡至水。脱腊后蒸馏水洗涤，3％H₂O₂作用15分钟阻断内源性过氧化物酶。5％正常牛血清（PBS稀释）封闭非特异性结合位点。滴加稀释后的一抗（M1～M4及VIP多克隆抗体），4℃过夜。M1～M4检测用辣根过氧化物酶标记的二抗。滴加DAB显色，镜下观察。VIP采用FITC标记的二抗后直接镜下观察。阴性对照应用PBS代替一抗。5、Western印迹蛋白煮沸5分钟。等量的蛋白通过14％的SDS-PAGE分离并转到硝酸纤维素膜上。用5％的脱脂牛奶阻断后，印迹用含有0.1％Tween20的PBS冲洗，加合适浓度的一抗4℃过夜。一抗分别为内参β-actin、抗M1～M4及抗VIP的多克隆抗体。过夜后，印迹用TBST冲洗，然后滴加辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时。冲洗后用增强化学发光法进行显影。蛋白条带的相对浓度用MSF-300G型扫描仪进行分析。6、统计方法数据以均数±标准差表示。独立样本t检验用于比较实验组与对照组之间的差异。P值小于0.05被认为有统计学意义。统计分析及作图应用SPSS13.0软件。结果1、形觉剥夺后的屈光状态形觉剥夺12天后的屈光状态：对照眼呈轻度远视状态（平均0.8D），形觉剥夺眼呈近视状态（平均-5.8D）。超声测量显示形觉剥夺眼的眼轴长度明显高于非形觉剥夺眼（P＜0.05）。2、mAChR及VIP的mRNA水平的表达mAChR：M1～M4在视网膜及巩膜上均有mRNA水平上的表达。PCR扩增产品的大小与各自预期的大小相符。阴性对照组无扩增产品出现，表明已用DNA酶处理的样品中无DNA基因组的污染。视网膜及巩膜组织中，形觉剥夺组与对照组的M1～M4受体的mRNA的表达均无差异（P值分别为0.671、0.330、0.866、0.516）。VIP：VIP在各标本视网膜中均有mRNA水平上的表达。实验组视网膜中VIP的表达明显高于对照组（P=0.000）。3、mAChR蛋白的表达3．1免疫组织化学mAChR：视网膜中，免疫组织化学染色显示所有的mAChR亚型（M1～M4）均可见于形觉剥夺组及对照组。M1～M4受体的免疫活性主要位于内核层的双极细胞，在无长突细胞中也有零散分布，并可见于节细胞层的部分细胞。M3和M4受体比M1及M2的免疫活性要明显强烈，但这4种受体在实验组与对照组之间的表达均没有明显的差别。巩膜中，免疫组织化学染色也显示M1～M4受体均可见于形觉剥夺组及对照组中。阳性染色呈黄色纺锤状（成纤维细胞），4种受体在实验组与对照组之间的表达均没有明显的差别。VIP：免疫荧光显示VIP在FDM组及对照组视网膜中均有表达，主要位于内丛状层（IPL）。FDM组的荧光信号比对照组明显强烈。3．2 Western印迹分析mAChR：Western印迹分析显示M1～M4受体蛋白存在于视网膜及巩膜组织中。M1条带位于52kDa、M2条带位于72kDa、M3条带位于75kDa、M4条带位于70kDa。此外，视网膜和巩膜的M3及M4条带明显比M1及M2条带强烈。每种受体蛋白在视网膜上的表达均高于巩膜。但视网膜及巩膜组织中，形觉剥夺组与对照组的M1～M4受体蛋白的表达均无差异（P＞0.05）。VIP：Western印迹分析显示VIP蛋白存在于视网膜中，条带位于20kDa处。VIP在FDM组中的表达明显高于对照组（P=0.003）。结论1、mAChR在豚鼠FDM模型视网膜及巩膜上的表达与对照组没有差异。mAChR抑制剂抑制眼球生长的作用是通过视网膜外和巩膜外的M受体机制或通过非M受体机制而发挥的。2、VIP在豚鼠FDM模型视网膜上的表达高于对照组，VIP在视觉诱导近视眼形成中对促进视网膜的生长发挥了重要作用。研究背景准分子激光屈光性角膜切削术（PRK）是第一种用于治疗近视的准分子激光角膜切削技术，于1988年首先应用于人眼，至今世界上已有数百万人接受了这种手术。PRK及以后发展起来的准分子激光上皮下角膜磨镶术（LASEK）及准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术（epi-LASIK），总称为“表面切削技术”。1990年代早期，角膜板层切开结合准分子激光技术治疗近视的技术首次报道，这种被命名为准分子激光角膜原位磨镶术（LASIK）的新技术，与PRK及其他表面切削技术相比，由于具有术后几乎无不适症状、视力恢复迅速等优点，已成为目前世界上最为常用的近视治疗方法。表面切削技术术后6个月及1年的随访研究结果表明，就视力和屈光效果而言，PRK及LASEK具有类似的结果，但两者的远期效果是否不同目前仍不明确。虽然已有数项研究对PRK的远期效果进行了报道，虽然最长期的12年随访提供了详细结果，但其所依据的是陈旧的切削参数。因此，对表面切削技术的远期屈光稳定性进行进一步评价十分必要。同时，LASIK与表面切削技术具有类似的视力及屈光效果随访已被短期随访研究所证实，但远期效果有无差异亦仍不明确。LASIK是一种选择性手术，远期随访对评价其屈光稳定性及潜在的并发症具有重要意义。特别是，LASIK术中要制作角膜瓣，其残留基质床的厚度要比表面切削更薄。研究目的以预测性、有效性、稳定性及安全性为主要指标，评价PRK及LASIK的远期视觉及屈光效果。患者及方法PRK病例系列：对1994年和1995年进行PRK术的近视患者的视觉及屈光效果进行长期（11年）前瞻性随访研究。共有46例患者（85眼）参加了全部随访。手术时的平均年龄为26.7岁（范围21～46岁），47％为男性、53％女性。术前平均近视度为—5.15D（范围-1.25D～-9.75D），根据近视屈光度将患者分为低、中、高3组。激光切削采用Summit apex准分子激光仪，手术区采用6mm。最后的11年随访于2006年6月进行，平均随访时间为135个月（范围121～143月）。LASIK病例系列：对1998年和1999年进行LASIK术的近视或合并散光患者的视觉及屈光效果进行长期（7年）前瞻性随访研究。共有59例患者（104眼）参加了全部随访，58.6％为男性、41.4为女性。术前平均等效球镜为—6.28D（范围-3.25D～-15.25D），将患者分为两组，中度组（-3.12～6.0D）及高度组（-6.12D以上）。角膜瓣制作采用Moria CB角膜板层刀，直径为8.0～9.5mm，瓣的预设厚度为160μm，角膜切削采用Summit apex plus准分子激光仪，手术区均为6mm。7年随访研究于2006年6月进行，平均随访时间为89个月(范围84～93月。最后一次随访时，患者的年龄平均为34.2岁（范围29～48岁）。患者术前及术后1年随访时的检查项目包括：裸眼视力（UCVA）、最佳框架眼镜矫正视力（BSCVA）、显然验光、裂隙灯检查、散瞳眼底检查。术后最后一次随访时除上述项目，还进行了角膜地形图、A超角膜厚度测量及术后并发症的观测。同时对患者进行了包括11各项目的问卷调查，以评估他们对手术的满意度。统计学分析包括：对视觉效果的描述性统计及对PRK和LASIK术后两个时间点的屈光结果分别进行配对t检验（P＜0.05被认为有统计学差异）。分析软件使用SPSS13.0。结果PRK术后11年，56.5％的眼屈光度在±0.5D范围内，81.2％的眼在±1.0D范围内。87％的眼视力在0.5以上，51.7％的眼视力在1.0以上。所用病例总计有26.43D的近视回退，其中23.55D位于高度组。中度组及高度组在术后3年和11年间的屈光度有统计学差异。BSCVA在90.6％的眼中不变或增加；有8眼丧失了术前的BSCVA。所有85眼均无术中并发症。术后11年，9％（4／46）的患者有眩光、光晕或其他夜间视觉问题。通过裂隙灯检查，主观判断有4眼存在haze，其中3眼在0.5级以下，1眼为0.5级。多数患者（89％）对术后效果满意。LASIK术后7年，89.4％的眼屈光度在±0.5D范围内，90.4％的眼在±1.0D范围内。100％的眼视力在0.5以上，94.2％的眼视力在1.0以上。术后1年及7年的平均显然验光等效球镜（MRSE）分别为0.29D及0.25D。中度近视组及高度组均无统计学意义上的近视回退（P＜0.05）。BSCVA在80.8％的眼中不变或增加。所有104眼均无术中并发症。术后7年，仅有2眼有层间异物残留。无弥漫性板层角膜炎、上皮植入等其他严重并发症。3.4％（2／59）的患者有眩光或光晕；10.2％（6／59）的患者有干眼症状。患者满意度很高（91.5％）。结论1．近视性PRK手术具有可预测、准确及安全的术后效果，术后远期高度近视有轻度回退。这些结果在某种程度上可以为LASEK及epi-LASIK的远期效果提供参考。2．LASIK手术具有可预测、准确及安全的视觉及屈光结果。屈光稳定性在术后7年内一直保持。无远期进行性并发症发生。3．PRK及LASIK远期均无进展性近视端及远视端漂移。