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目的:胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,每年全球约有超过100万的新发病例以及80万的死亡病例。目前,手术联合放化疗、免疫治疗以及靶向治疗仍然是胃癌治疗的有效手段,但由于肿瘤早期症状不典型且我国居民体检意识相对较弱,我国的早期胃癌检出率较低。因此,发现并揭示胃癌的特异性标记物及有效治疗靶点对疾病的诊治具有深远的意义。研究证实人类基因组中有98%的基因不具备编码蛋白的能力,因此被称为非编码基因。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指一类长度大于200个核苷酸且不具有开放阅读框的转录本。近年来,围绕lncRNA在胃癌中的作用及机制研究已成为学术热点,大量研究报道lncRNA可影响肿瘤的增殖、侵袭、迁移以及凋亡等表型变化。我们通过分析TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库发现lncRNA DLX6-AS1在胃癌中过表达并与预后相关。DLX6-AS1是长度为1990bp的转录组,位于7q21.3染色体上。已有学者报道DLX6-AS1在肝癌、骨巨细胞瘤、前列腺癌、肺癌、卵巢癌中过表达并起促癌作用。尽管如此,DLX6-AS1在胃癌中的作用及机制仍需我们进一步的探索及验证。本研究旨在明确DLX6-AS1在胃癌细胞系及组织中表达水平,并且通过生物信息学预测及一系列分子生物学实验,进一步揭示DLX6-AS1在胃癌中作用及潜在机制。我们检测了DLX6-AS1在胃癌中的表达水平并分析了其与临床病理学的关系。我们进一步证实了DLX6-AS1在胃癌增殖、侵袭、迁移以及在上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用,并通过分子生物学实验确定其竞争性结合的miRNA。最后,我们证实了DLX6-AS1/miR-204-5p所调控的下游靶基因以及调控DLX6-AS1过表达的转录因子,从而揭示了DLX6-AS1在胃癌中作用机制。研究方法:本研究中,我们下载了TCGA数据库中375例胃癌组织以及32例胃非癌组织的高通量数据,并使用R语言软件分析DLX6-AS1在不同组织中的表达及与预后的关系。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测DLX6-AS1在胃癌细胞系以及56对胃癌及对应非癌组织的表达情况,并分析其于临床病理学的关系。我们选取DLX6-AS1过表达胃癌细胞系SGC-7901和AGS转染si-DLX6-AS1,以敲除DLX6-AS1并同时设置对照组。通过CCK8、克隆形成和Transwell实验分别检测实验组和对照组细胞的增殖、侵袭和迁移能力。应用鬼笔环肽染色实验检测DLX6-AS1对肌动蛋白细胞骨架重构的影响,qRT-PCR和Western blot实验检测EMT相关基因的表达情况。生物信息学软件预测DLX6-AS1下游调控的miRNA并进行qRT-PCR实验进行初步筛选。通过荧光素酶报告基因实验证实miR-204-5p是否与DLX6-AS1预测序列相互作用。再次进行细胞功能实验证实DLX6-AS1/mi R-204-5p轴在胃癌发生、发展中的作用,并在转录及翻译水平检测其对EMT相关基因表达的影响。我们应用生物信息学软件预测miR-204-5p所调控的下游靶基因,并通过荧光素酶报告基因实验验证假设。在SGC-7901和AGS细胞系中联合转染相关siRNA及miRNA inhibitor后,进行细胞功能实验探索miR-204-5p/OCT1轴的生物学功能,并再次检测EMT相关蛋白的表达水平以及肌动蛋白重构情况。最后,利用JASPAR数据库预测联合荧光素酶报告基因和染色体共沉淀实验探索并揭示激活DLX6-AS1转录的转录因子。结果:1、DLX6-AS1在胃癌组织及细胞系中过表达。分析DLX6-AS1在375例胃癌及32例非癌组织中的高通量数据,提示DLX6-AS1呈过表达(P=0.0004)并与预后相关(P=0.042)。56例胃癌患者肿瘤组织及其对应的非癌组织的qRTPCR结果提示,DLX6-AS1在肿瘤组织中呈过表达(P<0.01),且DLX6-AS1的高表达与浸润深度(P=0.035)和远处转移(P=0.018)相关。同时,DLX6-AS1在胃癌细胞系中也呈高表达(P<0.01),其中SGC-7901和AGS细胞系的表达水平最高。2、DLX6-AS1促进胃癌的增殖、迁移和侵袭并调控EMT相关蛋白的表达。在SGC-7901和AGS细胞系中沉默DLX6-AS1并进行相关细胞功能实验,CCK8和克隆形成实验提示下调DLX6-AS1可有效抑制胃癌细胞的增殖速率(P<0.01)。Transwell结果也证实沉默DLX6-AS1后可抑制细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01)。通过qRT-PCR和western blot实验,我们进一步发现下调DLX6-AS1后可抑制N-cadherin(P<0.05),MMP9(P<0.05),SLUG(P<0.05)的表达并促进E-cadherin的表达(P<0.01)。鬼笔环肽染色也提示DLX6-AS1可参与肌动蛋白重构。3、DLX6-AS1作为竞争内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)结合miR-204-5p。通过生物信息学预测和初步筛选,我们初步确定DLX6-AS1可竞争性结合miR-204-5p。荧光素酶报告基因的实验进一步验证了之前的假设(P<0.05)。MiR-204-5p在胃癌组织和细胞系中低表达,并与肿瘤大小(P=0.003)、浸润深度(P=0.035)、远隔转移(P<0.001)和AJCC分期(P=0.033)相关。4、miR-204-5p可介导DLX6-AS1的促癌作用。联合转染后进行细胞功能实验,结果提示下调miR-204-5p后可部分逆转沉默DLX6-AS1所引起的抑癌作用。同时miR-204-5p也可在转录和翻译水平调控EMT相关基因的表达以及肌动蛋白细胞骨架的重构。5、OCT1是DLX6-AS1/miR-204-5p轴的靶基因。通过生物信息学预测和分子生物学实验证实OCT1是mi R-204-5p的靶基因,其表达与DLX6-AS1呈正相关(P=3.22E-10)并与miR-204-5p呈负相关(P=1.87E-4)。6、OCT1在胃癌中过表达并促进胃癌的进展和EMT。OCT1在胃癌组织和细胞系中表达上调。沉默OCT1后可有效逆转转染miR-204-5p inhibitor所造成的抑癌作用(P<0.01)。同时部分恢复E-cadherin(P<0.01)的表达并抑制SLUG和MMP9的表达(P<0.05)。7、OCT1激活DLX6-AS1的转录。通过生物信息学预测、荧光素酶报告基因实验以及ChIP实验,我们证实OCT1可激活DLX6-AS1的转录并确定了作用位点。OCT1和DLX6-AS1在56对胃癌组织中表达呈正相关(P=2.31E-8)。结论:1、DLX6-AS1在胃癌组织及细胞系中高表达。2、DLX6-AS1的高表达与胃癌的浸润深入和远处转移密切相关。3、DLX6-AS1能够促进胃癌的增殖、迁移、侵袭、肌动蛋白重构以及EMT。4、DLX6-AS1通过竞争性地结合mi R-204-5p发挥其生物学功能。5、OCT1受DLX6-AS1/miR-204-5p轴调控。6、DLX6-AS1/mi R-204-5p/OCT1轴促进胃癌的进展和EMT。7、转录因子OCT1激活DLX6-AS1转录。