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目的:探讨硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)对肝纤维化大鼠肝细胞增殖、凋亡的调节作用以及对P-p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)蛋白的表达的影响。方法:①CCl4复合因素法制备肝纤维化大鼠模型,胰酶两步灌流法提取肝纤维化大鼠肝细胞,台盼蓝染色检测细胞活性,细胞活性>90%,每只肝纤维化大鼠细胞产量>107,可继续后续实验;②MTT法检测肝纤维化大鼠肝细胞增殖:将新提取的肝细胞按2×104个/孔接种于96孔板,当细胞出现大片岛状连接时,用无血清WME培养基同步化处理12h,分对照组与实验组,实验组按照加药浓度梯度分组:H2S组将Na HS(H2S供体)按照25、50、75、100、200μmol/L浓度梯度给药,SB组分别按照12.5、25、50、100、200μmol/L浓度梯度给药,每组各设6个复孔。在5%CO2培养箱中继续培养48h后终止实验,每孔加入5g/L的MTT 20μL,培养箱中继续反应4h,吸出培养基,每孔加入150μL DMSO,震荡混匀10min。利用酶标仪于波长490nm处,测定各孔吸光度值(A),计算两种药物对各组细胞的增殖率、增殖抑制率;③流式细胞技术检测肝纤维化大鼠肝细胞凋亡率:将新提取的肝细胞按8×105个/孔接种至6孔板,在细胞出现大片岛状连接时,用无血清WME培养基同步化处理12h,分四组:正常对照组、H2S 50μmol/L组、SB20358025μmol/L组(SB组)、SB203580 25μmol/L+H2S 50μmol/L组(SB+H2S组),放入培养箱培养48h后消化收集各孔细胞,加入binding buffer和Annexin V-FITC/PI双染色剂,4℃避光。1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率;④Western blot法检测肝纤维化大鼠肝细胞中P-p38MAPK蛋白的表达:实验分对照组、H2S组、SB组、SB+H2S组,Western blot法检测细胞中P-p38MAPK蛋白的表达。结果:①采用改良的胰酶二步灌流法可获得大量的肝纤维化大鼠肝细胞,细胞活率>90%,细胞产量为(1-3)×107,能够满足实验要求;②原代提取的肝纤维化肝细胞培养48h后呈大片岛状连接,生长状态良好,可给予干预;③给予干预后,与对照组相比,低浓度H2S(50μmol/L)明显促进肝纤维化大鼠肝细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.05),对肝纤维化大鼠肝细胞凋亡无影响(P>0.05);SB203580可抑制肝纤维化大鼠肝细胞的增殖,伴随药物浓度的升高细胞存活率降低(P<0.05),并诱导肝纤维化大鼠肝细胞凋亡(P<0.05);P-p38MAPK蛋白在各组中均有表达,H2S组表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),SB组、SB+H2S组与对照组、H2S组相比,P-p38MAPK蛋白的表达量均减少,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论:①改良的胰酶二步灌流法是一种高效、实用的分离肝纤维化大鼠肝细胞的方法;②低浓度H2S对肝纤维化大鼠肝细胞凋亡无诱导作用,但能通过激活p38MAPK信号转导通路促进其细胞增殖。