论文部分内容阅读
研究背景和目的：创伤愈合是一个复杂的过程，包括炎症反应、细胞增殖和组织重建三个互相重叠的阶段。损伤自身作为一个信号启动修复机制至愈合完成。传统的观念认为创伤后首先启动的是止血过程，继之炎症细胞先后趋化至创面局部，参与创伤修复中的炎症反应。但最近研究发现活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）在调节创伤后早期炎症反应中具有重要的作用，ROS依赖的氧化还原系统是启动创伤修复级联反应中必不可缺的环节, ROS可以作为第二信使参与调节信号转导及调节基因表达等作用。创伤后早期炎症反应的主要炎症介质有5－羟色胺及前列腺素E2（ProstaglandinE2,PGE2）等，其中创伤局部的红、肿、热、痛主要与PGE2的产生相关。但创伤后PGE2快速升高的分子机制目前仍然不清。因此，本研究拟采用体外人皮肤角质细胞机械损伤模型，观察角质细胞损伤后ROS的产生，探讨ROS下游及上调PGE2上游的信号通路，试图阐明ROS介导的信号途径在创伤修复中早期炎症反应的作用机制。第一部分皮肤角质细胞损伤后升高的ROS上调PGE2目的研究人皮肤角质细胞机械损伤ROS生成增加对PGE2分泌的影响方法1、体外培养人皮肤角质细胞至第3-8代，利用该细胞建立机械损伤模型；2、将人皮肤角质细胞分为三组：a）单纯损伤组（接受机械损伤组）；b）Nox抑制剂（DPI）预处理+损伤组； c）无处理组（对照组）；3、机械损伤后0、1、5、10、15、30、60min收集细胞样本，荧光探针技术检测各组细胞ROS的生成；4、机械损伤后0、1、2、4、6、8、12、24h收集各组细胞上清液，EIA法检测PGE2含量的变化。结果1、在建模后不同时间点，损伤组人皮肤角质细胞ROS生成明显高于对照组，在损伤后1min开始有ROS生成，30min时点达到峰值（P<0.05）。2、机械损伤后人皮肤角质细胞分泌PGE2量明显升高，在损伤后6h抵达高峰（P<0.05）；机械损伤后24h PGE2量仍明显高于对照组（P<0.05）。3、使用DPI抑制Nox活性可明显减少机械损伤2h或4h后人皮肤角质细胞内PGE2的分泌量（P<0.05）。结论机械损伤可导致人皮肤角质细胞分泌PGE2明显增多，这与损伤后胞内ROS含量的升高和Nox酶活性的升高密切相关。第二部分皮肤角质细胞损伤后ROS通过活化ERK信号上调PGE2目的探讨皮肤角质细胞损伤后ERK信号是否参与调节ROS介导的PGE2生成方法1、体外培养人皮肤角质细胞至第3-8代，利用该细胞建立机械损伤模型；2、将人皮肤角质细胞分为四组：a）单纯损伤组（机械损伤组）；b）Nox抑制剂（DPI）预处理+损伤组；c）ERK抑制剂（PD98059）预处理+损伤组；d）无处理组（对照组）；3、机械损伤后0、0.25、0.5、1、2、4、6h收集样本，western blot检测各组细胞ERK、p-ERK的生成；4、各浓度Nox抑制剂DPI预处理细胞后进行划痕损伤，30min收集样本，western blot检测各组细胞p-ERK的生成；5、使用PD98059抑制ERK活性后进行划痕损伤，2h、4h收集各组细胞上清液，EIA法检测PGE2含量的变化。结果1、机械损伤后ERK磷酸化明显增多，在15min时磷酸化最为明显(p<0.05)，且在1h后恢复到正常水平。2、各浓度DPI预处理组人皮肤角质细胞p-ERK表达均低于单纯损伤组，其中DPI为10umol/L时，p-ERK显著下降（p<0.05）。DPI为1umol/l及5umol/l时，其p-ERK表达高于对照组（p<0.05）。3、PD98059预处理皮肤角质细胞，于损伤后2h、4h收集细胞上清液，损伤组上清中PGE2的质量浓度较对照组显著升高（p<0.05），PD98059预处理组产生PGE2均较损伤组显著降低（p<0.05）。结论皮肤角质细胞损伤后ERK信号被活化，激活的ERK信号参与调节ROS上调PGE2。第三部分ROS/ERK通过COX-2上调PGE2参与损伤后早期炎症反应目的探讨参与皮肤角质细胞损伤后炎症反应的信号通路及分子机制方法1、体外培养人皮肤角质细胞至第3-8代，利用该细胞建立机械损伤模型；2、将人皮肤角质细胞分为五组：a）单纯损伤组（机械损伤组）；b）Nox抑制剂（DPI）预处理+损伤组；c）ERK抑制剂（PD98059）预处理+损伤组；d）COX-2抑制剂（NS398）预处理+损伤组；e）无处理组（对照组）；3、机械损伤后0、1、2、4、6、8h收集样本，western blot检测各组细胞COX-2的生成；4、各浓度DPI、PD98059预处理细胞后进行划痕损伤，2h收集样本，western blot检测各组细胞COX-2的生成；5、使用NS398抑制COX-2活性后进行划痕损伤，2h、4h收集各组细胞上清液，EIA法检测PGE2含量的变化。结果1、机械损伤后COX-2蛋白表达水平呈逐渐增多的趋势，至2h COX-2表达水平升至最高(p<0.05)，且观察到在损伤后24h其含量仍比未损伤时升高。2、各浓度DPI+损伤组人皮肤角质细胞COX-2的含量均低于损伤组（p<0.05），其中DPI为10umol/L时，COX-2含量显著被移植下降（p<0.05）。3、各浓度PD98059预处理组中人皮肤角质细胞COX-2的含量均低于损伤组（p<0.05），其中PD98059为30umol/L时，COX-2含量显著下降（p<0.05）。4、NS398预处理皮肤角质细胞，于损伤后2h、4h收集细胞培养上清液，损伤组上清中PGE2的质量浓度较对照组显著升高（p<0.05），NS398预处理组产生PGE2均较损伤组显著降低（p<0.05）。结论ROS/ERK通过上调COX-2蛋白含量调节PGE2的生成，ROS-ERK-COX-2/PGE2信号途径参与了机械损伤后炎症反应。