过表达CD40L基因对Kasumi-1/ADM细胞株增殖、凋亡及耐药的影响

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目的:体外构建阿霉素(Adriamycin,ADM)耐药的Kasumi-1细胞株(Kasumi-1/ADM),初步探讨过表达CD40L基因对Kasumi-1/AD增殖、凋亡及耐药的影响。方法:⑴采用浓度梯度逐步递增ADM的方法,建立Kasumi-1/ADM耐药细胞株。⑵利用CCK-8法检测CD40L过表达对Kasumi-1、Kasumi-1/ADM细胞增殖的抑制率,计算两种细胞的IC50,确定其耐药指数(Resistance Index,RI)。⑶过表达CD40L慢病毒转染Kasumi-1/ADM细胞,流式细胞术检测病毒转染效率,q RT-PCR法验证CD40L基因过表达。⑷将转染后的细胞分为三组:Kasumi-1/ADM对照组、空转Kasumi-1/ADM组、过表达CD40L的Kasumi-1/ADM组,CCK-8法检测过表达CD40L对该三组细胞增殖-毒性的影响;Hoechst33342/PI双染法检测凋亡;q RT-PCR检测耐药及增殖相关基因MDR1、MRP、PCNA的m RNA表达水平变化。结果:⑴成功构建了针对ADM耐药的人急性髓系白血病Kasumi-1/ADM细胞株。ADM作用于Kasumi-1、Kasumi-1/ADM细胞24h后IC50有差异(P<0.05),其IC50值分别为0.88±0.04μg/m L、6.00±0.17μg/m L,Kasumi-1/ADM相对于Kasumi-1细胞的耐药指数为6.85±0.26。⑵慢病毒成功转染Kasumi-1/ADM细胞,经嘌呤霉素筛选后,空转组、过表达CD40L组Kasumi-1/ADM细胞的转染率分别为95.6%、96.9%;未转染组、空转组、过表达CD40L组Kasumi-1/ADM细胞的CD40L相对表达倍数分别为:1.00±0.07、1.03±0.19、215.09±28.83,过表达CD40L组细胞CD40L基因的相对表达水平较Kasumi-1/ADM组、空转组明显增加(P<0.05)。⑶过表达CD40L组Kasumi-1/ADM细胞与未转染组、空转组Kasumi-1/ADM细胞相比,增殖慢(P<0.05)。⑷柔红霉素(DNR)作用于未转染组、空转组、过表达CD40L组Kasumi-1/ADM细胞24h后,其IC50值分别为:5.819±0.101、5.915±0.102、1.502±0.050,过表达CD40L组细胞的IC50值明显低于未转染组、空转组(P<0.05)。⑸DNR干预前,未转染组、空转组、过表达CD40L组Kasumi-1/ADM细胞凋亡率分别为(1.72±0.11)%、(1.60±0.09)%、(7.33±0.45)%,干预后,其凋亡率分别为(9.17±0.93)%、(9.10±0.26)%和(35.87±1.70)%,差异有统计学意义(P<0.05)。⑹DNR干预前,未转染组、空转组、过表达CD40L组Kasumi-1/ADM细胞MDR1基因相对表达水平分别为:1.02±0.23、1.00±0.35、0.04±0.01;MRP基因相对表达水平分别为:1.04±0.31、1.00±0.20、0.13±0.01;PCNA基因相对表达水平分别为:1.04±0.35、1.03±0.45、0.49±0.18。干预后,三组细胞MDR1基因相对表达水平分别为:1.13±0.28、1.08±0.28、0.03±0.01;MRP基因相对表达水平分别为:1.21±0.52、1.11±0.32、0.07±0.01;PCNA基因相对表达水平分别为:1.00±0.45、1.08±0.06、0.42±0.15。过表达CD40L载体转染到Kasumi-1/ADM细胞后,其MDR1、MRP、PCNA基因的相对表达水平明显下调(P<0.05)。结论:⑴成功建立Kasumi-1/ADM耐药细胞株。⑵过表达CD40L基因对Kasumi-1/ADM细胞的增殖有抑制作用,能增加Kasumi-1/ADM细胞对DNR的化疗敏感性,导致MDR1、MRP、PCNA基因的表达水平下调。
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