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背景和目的:对于肝脏肿瘤、终末期肝病等肝脏疾病而言,肝部分切除术和肝移植术已成为一种常规且有效的治疗方法。随着人们生活水平的提升和生活方式的改变,肥胖已经成为一个全球普遍的现象,随之而来的是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)发病率的快速增加。NAFLD的高发病率,导致符合要求的正常供肝越来越少。等待肝脏移植的患者与器官供应短缺之间的矛盾日渐严峻,促使脂肪肝作为一个边缘供肝在临床上越来越多的被应用。在临床工作中,脂肪肝接受肝脏手术,如肝部分切术,也越来越普遍。与正常肝脏相比,脂肪肝更容易遭受脂质过氧化损伤,对缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)的敏感性升高、耐受性降低,是影响肝部分切除术和肝移植术后死亡率的一个重要因素。肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR),最初是从初断乳大鼠的肝脏或肝部分切除大鼠的肝脏中提取出一种蛋白,可以促进肝脏再生。后来研究发现ALR对多种不同类型的肝脏损伤亦具有保护作用。最近研究表明ALR与肝脏IRI亦有密切联系,通过减轻IRI时线粒体肿胀,减少细胞色素C漏出,从而减少肝细胞凋亡及坏死,保护肝脏免于IRI。然而,迄今为止,在NAFLD动物及临床研究中,未见ALR可否有减轻IRI报道。由此,我们制备NAFLD动物的IRI模型,研究ALR对其有无保护作用及可能机制,为减轻脂肪肝IRI提供新的治疗靶点。方法:用蛋氨酸胆碱缺乏(methionine choline deficient,MCD)饲料喂养C57BL/6小鼠2周,制备NAFLD动物模型。构建含ALR基因的重组腺病毒载体,并于MCD喂养第11天时通过尾静脉注射入小鼠体内(Ad ALR组),同时设立空载体对照组(Adnull组)、生理盐水组即模型组(NS组),继续喂养MCD饲料3天后行肝脏血流阻断术(结扎肝动脉、门静脉、胆管),制备肝脏IRI。而假手术组(sham组)除不进行结扎外,其余同肝脏IRI操作。收集动物血清测定肝功能指标(ALT,AST,LDH)等变化,肝组织切片HE染色观察肝组织结构变化;采用TUNEL,F4/80,PCNA免疫组化染色观察细胞凋亡和细胞增殖;Western bolt杂交方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,Caspase-3表达,观察细胞损伤和凋亡状况。检测脂质过氧化指标MDA和4-HNE水平,观察ALR对脂肪肝IRI的脂质过氧化反应有无作用。同时检测肝组织中的SOD,GSH活性,观察抗氧化能力。体外实验采用缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)处理肝细胞模拟体内肝脏IRI,用0.3m M的油酸/棕榈酸混合液(OA:PA=2:1)处理稳定转染ALR质粒的Hep G2细胞(ALR-Tx)和其对照细胞(Vector-Tx)6 h,诱导细胞脂肪变性。待细胞脂变成模后,采用H/R(2 h/3 h)处理,观察不同转染组细胞对H/R的抵御作用。检测CCK8表达判断细胞活力,检测Caspase-3活性判定细胞凋亡,Western blot杂交检测Bcl-2,Bax蛋白表达,观察各组细胞H/R损伤后的细胞凋亡,并用TUNEL染色加以确信。采用DCFH-DA探针和Mito SOX荧光染料分别检测总细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)及线粒体ROS含量。同时利用JC-1试剂检测线粒体膜电位的变化。应用Seahorse仪器检测线粒体耗氧率的变化,藉此,综合判断脂变肝细胞对抗H/R损伤的能力。最后,测定SOD,GSH等抗氧化酶活性及Mn SOD m RNA和蛋白表达水平,分析细胞抗自由基氧化体系变化。结果:1、Ad ALR组小鼠血清ALT,AST,LDH水平均较Adnull组降低(ALT:1452 U/L vs.502 U/L,p<0.01;AST 1138 U/L vs.558 U/L,p<0.01;LDH:3237 U/L vs.1891 U/L,p<0.05),肝组织学指标改善明显,肝细胞凋亡减少,提示ALR可以减轻非酒精性脂肪变小鼠肝脏IRI,抑制细胞凋亡。2、脂肪肝在IRI处理后肝脏脂质过氧化反应增强,但Ad ALR组小鼠肝脏脂质过氧化产物MDA含量降低,约为Adnull组的66%(p<0.01),另一脂质过氧化产物4-HNE的肝组织染色结果示Ad ALR组的4-HNE染色阳性面积较Adnull组显著减少(25%vs.5%,p<0.01)。抗氧化系统检测结果显示,与Adnul组结果相比,Ad ALR组SOD活性(80%vs.95%,p<0.05),GSH含量及(0.63μmol/g tissue vs.1.21μmol/g tissue,p<0.01)GSH/GSSG比值(0.78 vs.1.28,p<0.01)均升高。3、Ad ALR组小鼠肝组织中炎症因子TNF-a,IL-1b,IL-6和趋化因子CXCL2的m RNA水平较Adnull组明显降低,且F4/80免疫组化染色显示Ad ALR组阳性细胞数亦较Adnull组明显降低(1.3%vs.0.6%,p<0.01),提示ALR可以降低脂肪肝IRI后炎症因子释放并抑制库否细胞活化。Ad ALR组小鼠肝组织内PCNA阳性细胞数显著多于Adnull组(5.3%vs.28.6%,p<0.01),表明肝细胞增殖明显。4、脂变肝细胞经历H/R损伤后,与Adnull组细胞相比,ALR-Tx组细胞存活率增高(74.9%vs.90.9%,p<0.01)而Caspase-3活性降低(1.85%vs.1.42%,p<0.01),且TUNEL阳性细胞数明显减少(9.5%vs.4.0%,p<0.01)。5、脂变肝细胞经历H/R损伤后,与Adnull组细胞相比,ALR-Tx组细胞降低总ROS(1.75 vs.0.99,p<0.01)及线粒体ROS含量(1.36 vs.1.18,p<0.01)、稳定线粒体膜电位、提高ATP含量(56.7%vs.78.8%,p<0.01)及线粒体耗氧率(143.9pmol/min vs.227.9 pmol/min,p<0.01)。6、脂变细胞H/R损伤后抗氧化能力降低,但ALR处理后,脂变细胞SOD,GSH活性却有所提升,且Mn SOD的m RNA(1.85 vs.3.71,p<0.01)及蛋白水平(Mn SOD/actin,0.43 vs.0.82,p<0.01)均较Adnull组明显升高。结论:ALR通过减轻IRI肝组织的氧化应激反应,提高抗氧化能力、线粒体ATP含量及耗氧率,减少ROS产生,进而保护线粒体功能,有效地抑制NAFLD肝脏经历IRI后的细胞凋亡水平,从而最大程度地保护线粒体功能。本课题为今后临床工作中如何减轻脂肪肝IRI提供重要理论依据。