乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一种非细胞毒性嗜肝DNA病毒。HBV感染后可导致肝炎、肝硬化甚至肝癌的发生。每年约有65万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。HBV感染俨然已成为全球性的重要卫生安全问题。针对慢性HBV感染,抗病毒治疗显得尤为重要。迄今为止,抗乙型肝炎病毒药物包括两大类,一类是有限疗程的具有免疫调节作用的干扰素α(包括普通干扰素和聚乙二醇干扰素α),另一类是无固定疗程的具有直接抑制HBV DNA聚合酶作用的核苷或核苷酸类似物(nucleoside/nucleotide analogues,NAS),包括拉米夫定(lamivudine,LAM)、阿德福韦酯(adefovirdipivoxil,ADV)、替比夫定(telbivudine,LDT),恩替卡韦(entecavir,ETV)及替诺福韦(tenofovirdisoproxilfumarate,TDF)等。核苷(酸)类药物抗病毒的疗效已经得到认可。但病毒耐药变异也是核苷类药物应用过程中无法避免的问题,一旦出现病毒耐药变异就意味着该抗病毒药物的疗效下降或者是无效,患者病情也有可能进一步恶化。由于HBV编码逆转录酶区的HBVDNA聚合酶具有高效复制的特性,HBV的逆转录酶缺乏校对活性,同时由于其缺乏3’-5’外切酶活性,在复制过程中通过mRNA为中间体逆转录复制时,容易发生碱基配对错误,这种错配率远远高于其他的DNA病毒,因而导致HBV基因高突变的特性,进而产生耐药,这也可能是预存耐药存在的原因。问题是我们临床遇到的病毒耐药变异是预存耐药还是药物诱导发生?既然有预存耐药存在的可能,那么是否有必要在服用核苷类药物之前开展HBV基因耐药变异检测?还有预存耐药变异与药物诱导耐药变异有无不同?耐药变异通常位于HBV聚合酶区的逆转录酶(Reverse transcriptase region,RT)区,而编码表面抗原的HBV S基因(nt 155-835)完全重叠于其逆转录酶区(Reverse transcriptase RT)(131-1161)之内,两者在同一方向上通过移码的方式各自翻译。因此RT区某些碱基发生改变时,不可避免地会导致S基因相应位点发生改变。而逆转录酶区第181位氨基酸的变异不仅仅使得HBV对阿德福韦酯产生耐药,而且对拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦的药物敏感性均呈现不同程度下降,因此,rt181位是一个核苷和核苷酸药物的交叉耐药位点。而该位点变异可引起S基因的改变。有研究表明HBV rtA181T的变异可导致其对应位点的S基因由TGG→TAG,TAG为终止密码子,不再编码蛋白质,致使S抗原出现sW172*的改变,导致表达S抗原的55个氨基酸的截短,此种变异也称为rtA181T/sW172*变异,此种变异可影响到HBV的生物学特性及其致病性。这种截短了的病毒蛋白通常有分泌障碍,被阻滞在肝细胞内,无法分泌到血液中,血清HBsAg含量随之降低。另外,RtA181T变异除了可导致S抗原出现sW172*的改变之外,亦可导致S抗原出现sW172L的变化,此变异株产生的病毒蛋白亦有分泌障碍,血清中测得的HBsAg也会降低。有研究表明rtA181T/sW172*变异可诱导肝癌的发生。从目前研究结果来看,rt181位变异后可能会造成多种核苷酸类药物耐药或敏感性下降,也可能会影响表面抗原的表达和对HBV感染的监测,更有甚者可能会导致肝癌的发生。而我们在临床上观察到rtA181变异不仅存在于肝癌患者中,在慢性乙型肝炎患者中也存在。因此本研究旨在探索在慢性HBV感染者中是否存在预存耐药?预存耐药的模式是怎样的?预存的耐药变异与抗病毒药物诱导的耐药变异有无不同?耐药变异与HBV基因型及病情进展有无关系?rt181位变异后对S基因影响如何?该位点变异对临床有无影响?基于这些想法我们设立了该项研究。本研究分以下三部分进行:第一部分:慢性乙型肝炎病毒感染者预存耐药分析第二部分:病毒学突破的慢性乙型肝炎病毒感染者HBV多聚酶区基因序列分析第三部分:慢性乙型肝炎患者rt181位变异对S区基因的影响第一部分:慢性乙型肝炎病毒感染者预存耐药分析研究背景如何阻止或者延缓慢性乙型肝炎患者病情的进展对于肝病研究者而言是一个严峻的问题。因为到目前为止人们仍然没有找到能绝对消灭乙型肝炎病毒的方法或武器。对于慢性乙型肝炎的治疗,目前抗病毒治疗是唯一能够有效的最大限度抑制病毒复制和延缓病情进展的方法。在抗病毒药物中,NAs对CHB的抗病毒疗效已得到肯定。但目前所有口服NAs,包括拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)、替比夫定(LDT)、恩替卡韦(ETV)等在治疗过程中均可出现不同程度的耐药。因此耐药株的存在给乙型肝炎的治疗带来了极大的困难。但这些耐药株是在用药之始就存在还是由于用药而诱发的呢?慢性乙型肝炎患者在服用NAs抗病毒治疗过程中亦有原发无应答现象,那么其原发无应答的原因何在?是否与其感染的乙型肝炎病毒本身就有预存耐药变异存在呢?如果预存耐药变异存在,这种预存耐药的模式如何,其发生与肝病进展的不同阶段有没有关系?耐药与基因型有无关系?目前这些问题都还没有阐明。是否应该在抗病毒治疗之前进行基因耐药检测也说法不一。为了明确上述问题,我们设立了此项研究,以期能够了解在慢性HBV感染者中是否存在预存耐药,预存耐药与基因型的关系,预存耐药与病情进展的关系。研究目的1.了解江苏徐州地区慢性乙型肝炎病毒感染者中HBV基因型分布情况。2.观察慢性乙型肝炎病毒感染者中存在预存耐药情况及其耐药变异发生的模式。3.观察预存耐药与HBV基因型及病情的关系。研究方法收集357例没有抗病毒治疗的慢性HBV感染者外周血,全自动生化分析仪检测肝功能相关指标,化学发光微粒子免疫检测法定量测定HBV-M。利用PCR产物直接测序法检测HBVDNA聚合酶(P)区基因序列,测序结果在NCBI的Genotyping tool上进行比对,确认所扩增的病人血清中HBV DNA基因型。所有计量数据均以均数±标准差(x± s)表示,比较B、C基因型HBV-DNA水平,先行方差齐性检验,然后进行单因素方差分析并进行两两比较。不同基因型之间变异发生率的比较采用x2检验。检验水准为双侧α = 0.05,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果357例慢性乙型肝炎病毒感染者中发现与拉米夫定相关的预存耐药变异在慢性乙型肝炎(CHB)组检测到8例(3.7%),肝硬化(LC)组13例(11.7%),肝癌(HCC)组6例(21.4%),与阿德福韦酯相关的预存耐药变异在CHB组检测到10例(4.6%),LC组15例(13.5%),HCC组4例(14.5%);拉米夫定和阿德福韦酯均相关的预存耐药变异在CHB组检测到2例(0.9%),LC组1例(0.9%),HCC组1例(3.6%)。与拉米夫定相关的预存耐药变异及与阿德福韦酯相关的预存耐药变异发生率各组之间比较有统计学意义(P<0.01)。且上述耐药变异均发生在C基因型中,B基因型中没有发现有预存耐药的发生。检测到的耐药模式主要是 rtS213T(4.8%),rtV214A(3.6%),rtN/H238T/D(3.1%)的变异。原发耐药变异(rtA181T/V,rtM204V/I/S,rtN236T,and rtM250I/V)发生率较低,而补偿变异如 rtV173L,rtV214A,rtQ215S,and rt N/H238T/D 却有较高的发生率。研究结论1.江苏徐州地区的慢性乙型肝炎感染者感染的HBV基因型主要为C型和B型。2.在慢性乙型肝炎病毒感染者中存在拉米夫定和阿德福韦酯的预存耐药,预存耐药模式主要是补偿变异。3.预存耐药的发生与肝病进展有关,肝病终末期预存耐药发生率高。4.预存耐药发生与基因型有关,HBVC基因型较B型容易发生耐药变异。第二部分:病毒学突破的慢性乙型肝炎患者HBV多聚酶区耐药变异分析研究背景在慢性乙型肝炎抗病毒治疗的药物中,核苷(酸)类似物(nucleos(t)ide analogues,NAs)的疗效已得到肯定。但目前所有口服NAs,包括拉米夫定(lamivudine,LAM)、阿德福韦(adefovir dipivoxil,ADV)、替比夫定(telbivudine,LDT)等在治疗过程中均可出现不同程度的耐药性。虽然初始选用恩替卡韦(entecavir,ETV)耐药率比较低,而对已经发生拉米夫定耐药的患者用恩替卡韦治疗5年其耐药发生高达51%,对拉米夫定耐药的HBV合并HIV感染者在使用TDF治疗过程中也出现了病毒学突破。因此耐药株的存在给慢性乙型肝炎的治疗带来了极大的困难。近来前瞻性研究表明抗病毒药物的耐药对于乙型肝炎肝硬化失代偿患者尤其是挽救治疗失败的患者而言将增加其肝细胞癌发生的风险。为了避免耐药的发生,指南推荐在NAs中替诺福韦和恩替卡韦作为抗病毒治疗之首选。但由于在中国TDF上市晚(直到2014年7月还没有上市),同时因为经济的原因,很多慢性乙型肝炎感染者在初始抗病毒时往往选用的是ADF或是LAM或者是两药的联合应用,因此这些人在抗病毒治疗过程中需要密切观察,定期复查HBVDNA,一旦发现病毒学突破,尽早检测耐药变异,据此及时调整抗病毒治疗方案,控制病情进展,减少病毒突破乃至反弹对机体造成的再次打击相当重要。另外病毒学突破的患者中其基因耐药变异与HBV基因型及病情进展有关还是与所用抗病毒药物有关到目前为止没有明确结论。为此我们设定了如下研究。研究目的1.探讨病毒学突破的慢性HBV感染者基因耐药变异情况。2.探讨病毒学突破的慢性HBV感染者基因耐药变异与HBV基因型及病情的关系。研究方法收集141例出现病毒学突破的慢性HBV感染者外周血,PCR扩增HBV聚合酶(P)基因,PCR产物直接测序检测HBV的聚合酶基因序列。全自动生化分析仪检测肝功能相关指标,化学发光微粒子免疫检测法定量测定HBV-M。在招募的患者中,慢性乙型肝炎(CHB)59例,肝硬化(LC)68例,原发性肝癌(PLC)14例。曾用阿德福韦酯(ADV)治疗51例,拉米夫定(LAM)或替比夫定(LDT)治疗39例,恩替卡韦(ETV)治疗10例,LAM或LDT续贯ADV治疗41例。组间变异率采用x2检验比较。研究结果1.在不同的治疗组之间,患者的年龄、性别、ALT水平及HBVDNA载量比较都没有统计学差异,P>0.05。2.HBV基因型的分布141例病毒学突破的慢性HBV感染的患者中检测到的HBV基因型主要是C型138/141(97.9%),B型仅有3例(2.1%)。没有检测到其他的基因型。3.不同治疗组耐药变异模式分布在ADV治疗组检测到的耐药变异模式主要是rtA181T/V或rtS213T单点变异及含有rtA181T/V或rtS213T的多点变异模式,LAM/LDT治疗组检测到的变异模式主要是rtL180M+ rtM204I/V/S和rtM204I/V/S或含有204位点的多点变异模式;ETV治疗组出现耐药模式为含有rtL180M+ rtM204I/V/S的多位点变异同时存在;LAM/LDT序贯ADV组出现耐药变异类型为多位点同时对ADV及LAM耐药的复杂变异模式。出现耐药变异频数最多的是rtM204I/V/S(35.5%),其次是rtL180M(22.7%),再就是 rtA181T/V(19.1%)。4.耐药变异与治疗药物的关系比较不同抗病毒药物治疗组发生耐药变异的频数时发现LAM/LDT序贯ADV组出现耐药变异30例(30/41,82.1%),LAM/LDT组出现耐药变异28例(28/39,71.8%),ADV抗病毒治疗组出现耐药变异20例(20/51,42%),ETV组出现耐药变异3例(3/10,30%)。各组耐药变异发生有明显统计学差异,P<0.01。5.耐药变异与病情的关系141例慢性HBV感染者中,CHB组共59例,出现耐药变异30例(30/59,50.8%),LC组68例,出现耐药变异40例(40/68,58.8%),PLC组14例,出现耐药变异12例(12/14,85.7%)。似乎随着病情进展耐药发生比例有增加之势,但统计学上没有差异,P=0.059。研究结论1.拉米夫定/替比夫定序贯阿德福韦酯治疗后出现耐药变异发生率最高,其次是单用拉米夫定或替比夫定,恩替卡韦耐药变异率最低。2.病毒学突破的耐药变异发生率与初始选择的核苷类药物有关而与病情进展无关。3.病毒学突破的耐药变异发生率与HBV基因型有关,C型比B型更容易发生耐药。第三部分:慢性乙型肝炎患者rt181位变异对S区基因序列的影响研究背景核苷(酸)类(nucleos(t)ide analogues,NAs)药物抗乙型肝炎病毒的疗效已经得到医学界的广泛认可。但随着NAS治疗时间的延长往往会出现不同程度的病毒耐药,从而影响其抗病毒治疗效果,而逆转录酶区第181位氨基酸的变异给核苷类药物抗病毒治疗提出了一个新的“挑战”,因为该位点变异后会导致HBV不仅仅对阿德福韦酯产生耐药,而且对拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦的药物敏感性均呈现不同程度下降,且该位点变异不仅可在阿德福韦酯治疗过程中诱发,也可在替比夫定治疗过程中出现。在从未抗病毒治疗的患者存在耐药变异被称为预存耐药,而我们前期研究中发现rtA181V/T变异也存在于从未抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者中。目前体外实验结果提示,rtA181T/V变异的病毒对大部分核苷(酸)类药物均呈现一定程度的耐药性。由于HBV的S基因(nt155-835)完全重叠于其逆转录酶RT基因(nt131-1161),故当RT区某些碱基位点发生突变变异时,会导致S区相应位点发生改变,从而导致S基因转录形成的密码子发生变化,进而导致密码子编码的HBsAg蛋白发生相应变化。rtA181T突变模式也可导致HBsAg发生截短突变或替换突变,如rtA181T/sW172*变异及rtA181T/sW172L变异。这种有截短/替换突变的有缺陷的HBsAg,可导致肝细胞发生癌变也可导致血清中HBsAg水平的下降。在临床中我们观察到rt181位变异不仅发生在肝癌患者中,在慢性乙型肝炎患者中也存在。那么在慢性乙型肝炎患者中存在的预存耐药与阿德福韦酯诱发的耐药变异模式有无不同?rt181位基因变异与S区基因变异有无关系?对HBsAg的表达有何影响?这种变异与基因型有无关系?基于这种想法我们设定了此项研究。研究目的1.了解慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者的预存耐药变异与基因型的关系。2.了解预存耐药及阿德福韦酯诱发耐药变异的异同。3.探讨慢性乙型肝炎患者rt181位变异对S区基因序列的影响。4.了解Rt181变异对血清HBsAg含量的影响。研究方法募集298例CHB患者,其中包括226例未抗病毒的CHB患者和曾用阿德福韦酯抗病毒治疗效果不佳或出现病毒学突破的72例CHB患者,采集外周血,全自动生化分析仪检测肝功能相关指标,化学发光微粒子免疫检测法定量测定HBV-M,PCR产物直接测序法检测HBVP基因序列,设计特异性引物扩增S区并进行基因序列分析。计数资料采用X2检验;定量资料以均数±标准差(x± s)表示,统计方法采用单因素方差分析。检验水准为双侧α =0.05,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.298例CHB患者共检测到2种基因型,其中C型281例(94.3%),B型17 例(5.7%)。2.226例未抗病毒治疗的CHB患者中,C基因型211例,B基因型15例。检测到预存耐药变异16例(7.1%),基因型均为C型。其中与拉米夫定耐药相关的有rtV 207L 1例,rtS213T 5例;与阿德福韦酯耐药相关的有8例,分别为rtA181T1例,rtV214A3例,rtN/H 238D/S/T4例。与拉米夫定和阿德福韦酯耐药均相关的 rtV207I+ rtN/H 238D 1 例,rtS213T + rtN/H 238S 1 例。B基因型中未检测到耐药变异。3.72例阿德福韦酯治疗的CHB患者中,C基因型70例,B基因型2例。发生耐药变异的有30例(41.7%),其中与拉米夫定耐药相关的有1例,为rtS213T;与阿德福韦酯耐药相关的有25例,分别为rtA181T 7例,rtA181V 10例,rtA181T+rtN236T 2 例,rtA181T+rt238T 1 例,rtA181V+rt238S 2 例,rtV 214A 1 例,rtN 236T 2例;检测到与拉米夫定和阿德福韦酯耐药均相关的变异有4例,分别为 rtA181T +rtV207I 1 例,rtA181T +rtV207I +rtN236T 1 例,rtS213T+ rtV 214A 1例,rtN 236T+ rtM 250L 1例。上述发生基因变异的病例中有1例为B基因型,为rtN 236T变异,其余均为C基因型。4.两种基因型CHB患者在年龄、性别、HBVDNA载量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。5.有5例rtA181T变异的患者及2例rtA181T+rtN236T患者,其对应的S区第172位氨基酸由色氨酸(Trp,W)变为亮氨酸(Leu,L),即rtA181T/sW172L,其中1例rtA181T变异的患者同时发生了 sw182位氨基酸的碱基突变为终止密码子TGA。3例rtA181T变异的患者和另外3例含有rtA181T多位点变异(rtA181T+rtV207I、rtA181T +rtV207I+ rtN236T 和 rtA181T+rt238T)的患者 S 区编码第172位氨基酸的碱基突变为终止密码子(TGA),造成S区的截尾突变,即rtA181T/sW172*;10 例 rtA181V 变异的及 2 例 rtA181V+rt238S 患者的 S 区第 173位氨基酸由亮氨酸(Leu,L)变为苯丙氨酸(Phe,F),即rtA181V/sL173F。6.298例CHB患者中,检测到2例Pre-S2起始密码子突变(ATG→ATA),该2例患者均为rtA181V变异者。7.RtA181T变异组与rtA181V变异组患者的年龄及血清病毒量之间的差异无统计学意义(P>0.05)。rtA181T和rtA181V变异组患者血清HBsAg水平显著低于未变异组患者,(P<0.01)。研究结论1.在CHB患者中存在预存耐药。2.HBVC基因型比B基因型容易发生耐药变异。3.预存耐药与ADV诱导耐药变异的模式不同,ADV诱导耐药变异发生的主要模式原发耐药变异,而预存耐药变异主要是次要耐药变异。并且预存耐药发生率低于阿德福韦酯诱导耐药。4.在阿德福韦酯治疗过程中出现病毒学突破或治疗效果欠佳时发生rtA181T/V风险较高。5.HBV rtA181T变异均伴随着sW172L或sW172*的变异。rtA181V变异均伴随着sL173F的变异,也可能伴随有Pre-S2起始密码的终止变异。6.rtA181变异的CHB患者HBsAg水平下降。