论文部分内容阅读
ε-聚赖氨酸（ε-Poly-L-Lysine）是由微生物发酵合成的一种由赖氨酸单体通过ε-酰胺键形成的多肽。ε-PL具有优良的抑菌作用，对革兰氏阳性菌和阴性菌、酵母和一些病毒都有抑制作用，而且兼有水溶性好、热稳定性高等特点。目前，ε-PL已广泛用于食品加工和储藏的防腐保鲜、可降解生物材料、药物包被物、靶向药物载体以及医学研究中。 本文以白色链霉菌（Streptomyces albulus）为ε-PL的生产菌株，以提高ε-PL产量，优化发酵工艺，研究ε-PL分批发酵方法的规律以及预测ε-PL的结构为主要研究目标，研究内容包括：①ε-PL生产菌株的形态和生理生化特征鉴定以及ε-PL生产菌株的选育；②培养基和培养条件的优化；③分批发酵中搅拌和pH对ε-PL发酵的影响；④ε-PL二级结构和部分性质的预测。 主要研究结果如下： 1．确定了初筛抗性标记AEC和甘氨酸以及相应的临界浓度，分别是6mg/mL和3mg/mL，选用抑菌圈法作为第一次复筛方法，通过ε-PL对酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌的抑制试验，证明枯草芽孢杆菌对ε-PL最敏感，H/C值最大。 2．用紫外线（UV）和硫酸二乙酯（DES）分别对白色链霉菌Streptomyces albulus TF-1进行诱变处理。首先研究了紫外线诱变中不同照射剂量对细胞存活率的影响，作出了诱变曲线，同时根据诱变的普遍规律，即高突变率出现在高剂量的原则，确定紫外线诱变25S为最佳诱变剂量，紫外诱变后，经初筛和两次复筛得到一株产量为0.51g/L的突变株，比野生型菌株的ε-PL产量提高37.8％。 以紫外诱变获得的突变株为出发菌株，用化学诱变剂DES进行了再次诱变。首先根据诱变剂用量和诱变时间对细胞存活率和突变率的影响，作出诱变曲线，得出最佳诱变条件为：1％（体积百分比）和25min。对突变株进行化学诱变后，经初筛和两次复筛得到一株产量为0.79g/L的突变株，产量提高了54.9％。 对上述突变株进行了遗传稳定性实验。经5次传代后的发酵实验结果表明突变株性状稳定。 3．不同的碳源和氮源对ε-PL产生有明显的不同，葡萄糖和硫酸铵分别是最佳的碳源和氮源。对组合氮源进行了研究，发现硫酸铵和酵母粉复合使用更有利于ε-PL发酵。在发酵液中添加无机盐对ε-PL发酵有不同的影响，其中K2HPO4、KH2PO4和MgSO4对发酵有一定促进作用，而ZnSO4和FeSO4几乎没有影响。 采用中心组合设计对影响发酵产量的培养基主要成分葡萄糖、硫酸铰和酵母粉的含量进行了忧化，得出了忧化模型；优化后培养基组成为；葡萄糖5％，硫酸铰l．5％，酵母粉1％；KZHPO。0．l％；MgSO。0．l％；KH。PO。0．15％，卜聚赖氨酸的预测产率为＊石gg／L。 对培养条件的研究表明：当装液量为 50mL，初始 pH为 6刀，接种量 8％，培养温度30C时，卜干L的发酵产量最高，为1．83g／L。4．采用 SL小型发酵罐，对。PL分批发酵中搅拌速率和 pH的影响进行了研究。发现搅拌速率提高对菌体生长和。PL的合成有显著的促进作用；但搅拌速率过高会将菌体打碎，导致细胞死亡，。PL产量下降。实验证明当搅拌速率维持在 350rpm左右时，产物得率最高为 0．0688 g．卜PL乍．sub。 pH值对菌体生长和。干L合成旦有明显影响，当pH维待45以上，有利于菌体生长：当pH低于3．5时，对菌体生长有抑制作用；但州对。PL合成的影响Z时B反，pH为 40时，促进卜干L的合成，而 pH为 6刀时，没有。干L的合成。 在最佳搅拌速率和 pH的控制条件下进行卜聚赖氨酸发酵，菌体量为9．刀g儿，。－队产量达至2．9＊叭，产物得率为0刀62 g。－巩／sub。5．用高效液相色谱对聚赖氨酸标准品和发酵样品进行了分析检测，标准品色谱图为单一色谱峰，保留时间为8．4们m山；发酵样品在8刀5加 处有一强色谱峰，与标准品色谱峰的保留时间桐同。6．利用在线网络预测了。－聚赖氨酸的二级结构、亲水性和空间结构。从数据分析显示，。－聚赖氨酸主要的二级结构单元为a一螺旋结构，还有部分无规卷曲结构。有较强的亲水性，暴露残基数多于内部残基数，多肽链呈非球形空间结构。