‘中热1号’香蕉抗枯萎病突变位点验证

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香蕉(Musa acuminata)是热带亚热带地区重要的水果,富含丰富碳水化合物和微量元素。香蕉枯萎病是目前严重制约香蕉产业发展的因素之一。该病由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.Cubense,Foc)侵染引起,包含四个生理小种,其中4号生理小种危害性最大。香蕉枯萎病的主要防治方法有化学防治、生物防治、轮作与套种及综合防控。但是这些防治方法都不能从根本上解决香蕉枯萎病这一难题。目前,最为有效的解决方法是培育出具有抗枯萎病的香蕉品种。辐射诱变育种是当今香蕉育种最常用的方法。我们实验室通过用60Co-γ射线辐射巴西蕉(Musa acuminata L.AAA group,cv.Cavendish)未成熟雄花诱导的愈伤组织,获得1个具有较强抗枯萎病能力和良好经济性状的突变体,命名为“中热1号”。本研究对中热1号的抗病性进行初步分析:1.首先将巴西蕉的基因组重测序数据与A基因组进行比对,得到巴西蕉相对于A基因组的遗传变异图谱。将中热1号重测序得到的数据与巴西蕉的遗传变异图谱进行比较,得到中热1号相对于巴西蕉的单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(Indel)、染色体结构变异(SV)和拷贝数变异(CNV)的数量分别为10,140,489个、1,303,290个、111,090个和29,273个。结果表明,中热1号中发生的诱变类型是SNPs>InDel>CNV>SV,在全基因组范围及单核苷酸水平上揭示了 60Co-γ射线诱发香蕉三倍体变异的频率与特征。2.将接种Foc TR4 0天和2天的中热1号根系进行转录组测序分析,在侵染2天的中热1号根系中有2,235基因相对于侵染0天发生差异表达。通过KEGG富集分析得出,中热1号接种Foc TR4 2天在植物病原菌互作途径中注释214个DEGs,其中9个生物合成途径参与植物PTI反应,6个生物合成途径参与植物ETI反应。由此可见,植物病原菌互作途径在中热1号抗香蕉枯萎病的过程中重要作用。3.为了验证启动子的突变位点,本研究将全基因组重测序和转录组差异表达数据取交集,获得与辐射诱变有关的抗病基因。主要分析了中热1号“植物-病原菌互作”途径中与抗病密切相关的成员,参照转录组的表达量,筛选RPKM值大于0.3以上的成员,最后得到18个重要的候选基因。经过PCR扩增得到12个目的基因的启动子序列,对12个目的基因序列进行生物信息学分析,鉴别出由辐射诱变产生的突变位点(SNP和Indel),且这些突变使中热1号的启动子元件相对于巴西蕉的启动子元件发生变化。根据重测序及转录组数据选出差异显著的基因Ma0111500.1,转录组KEGG富集途径对该序列注释分析表明该序列是香蕉RPM1基因,命名为MaRPM1。在中热1号和巴西蕉中克隆出的MaRPM1基因启动子,分别命名为MaRPM1Z1、MaRPM1BX,并对启动子功能进行验证。结果表明MaRPM1基因启动子在中热1号和巴西蕉中均具有启动活性,且在中热1号中的启动活性比在巴西蕉中的高。初步解析了中热1号的突变位点的分子特征,为突变体的鉴定提供可靠的方法,加速抗病突变体的应用。
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