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目的:通过比较Anx A1基因敲除型大鼠和野生型大鼠体外循环(CPB)后肺损伤的情况及应用拟肽Ac2-26对肺损伤的影响,探讨Ac2-26对大鼠CPB肺组织的保护作用和机制。方法:分成全身Anx A1基因敲除(Anx A1-/-)大鼠(KO大鼠)和野生型SD大鼠(WT大鼠)两个组,每个组再分成4个亚组,分别为假手术组(WT-S组和KO-S组)、肺缺血再灌注组(WT-IR组和KO-IR组)、Ac2-26组(WT-A组和KO-A组)和Ac2-26+Boc2组(WT-B组和KO-B组)。每个亚组6只大鼠,每个组24只,总共48只大鼠。所有大鼠用1%戊巴比妥(50mg·kg-1)腹腔注射麻醉,仰卧位固定于手术板上,喉镜明视下气管插管,确认气管插管在位后连接呼吸机,机械通气。行尾静脉穿刺置管用于给药,分离两侧股静脉及右侧颈动脉并穿刺置管,分离一侧股动脉连接生物信号采集处理系统监测大鼠生命体征。除WT-S和KO-S组外,其余6组均建立体外循环肺损伤模型。WT-A和KO-A组在体外循环前10分钟经尾静脉注射Ac2-26,WT-IR和KO-IR组在同时间点注射等容量的NS,WT-B和KO-B组在同时间点给予Boc2(FPR受体特异性拮抗剂)后再注射Ac2-26;WT-S和KO-S组只行血管穿刺置管和开胸,不做其他处理。分别在体外循环前(T1),开放肺门即刻(T2)以及实验结束时(T3)取动脉血进行血气分析检测;假手术组大鼠在机械通气后30分钟为T1时刻,之后在肺损伤模型的相同时间点,即T1后75分钟(开胸30分钟夹闭左侧肺门45分钟)取T2时刻的动脉血,T2后120分钟(循环30分钟停机继续机械通气90分钟)取T3动脉血行血气分析检测,并计算出大鼠各时刻的氧合指数(OI)和呼吸指数(RI),术中记录大鼠生命体征。实验结束后处死大鼠取左肺组织,用苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织形态学改变;电子显微镜下观察肺泡II型上皮细胞的状态;ELISA法检测肺组织TNF-α的含量;端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口标记技术(TUNEL)染色法检测肺组织中性粒细胞的凋亡率;Western blot法检测Anx A1和ICAM-1的表达。结果:(1)各组大鼠心率(HR)及平均动脉压(MAP)的变化:WT大鼠在同时点比较,WT-IR、WT-A和WT-B三组在T2和T3时刻HR和MAP都明显低于WT-S组(P<0.05)。WT-A组在T3时刻HR较WT-IR和WT-B组明显增高(P<0.05)。WT大鼠在不同时点比较,WT-IR、WT-A和WT-B三组MAP在T2和T3时刻较T1时刻明显下降(P<0.05),三组在T3时刻MAP较T2时刻升高有统计学差异(P<0.05)。WI-IR组和WT-B组在各时刻HR及MAP的差异无统计学意义(P>0.05)。KO各组大鼠HR和MAP的变化趋势与WT大鼠一致。KO各组大鼠与WT各组大鼠比较,KO-S与WT-S组、KO-IR与WT-IR组、KO-A与WT-A组和KO-B与WT-B组分别比较,HR和MAP在同时点均无明显差异(P>0.05)。(2)各组大鼠肺功能的变化:WT大鼠各组在T1时刻OI和RI无统计学差异(P>0.05),WT-IR、WT-A和WT-B组OI在T2和T3时点较T1明显降低(P<0.05),RI在T2和T3时点较T1时点显著增高(P<0.05)。在T3时刻,WT-A组的OI较WT-IR和WT-B组明显增高(P<0.05),RI则显著降低(P<0.05)。WI-IR组和WT-B组在各时刻OI及RI的差异无统计学意义(P>0.05)。KO各组大鼠OI和RI的变化趋势与WT大鼠一致。KO各组大鼠与WT各组大鼠比较,在T3时刻,KO-IR与WT-IR组、KO-A与WT-A组、KO-B与WT-B组比较,OI均明显降低(P<0.05),RI均显著增高(P<0.05)。(3)各组大鼠肺组织光镜结果和病理损伤评分:WT-S组的肺组织结构清晰,未见明显损伤和炎症反应;WT-A组肺组织结构清晰,肺泡壁断裂较少,有少量炎症细胞浸润;WT-IR组和WT-B组肺组织结构紊乱,肺泡壁断裂较多,肺泡内见大量渗出的水肿液,并有大量炎症细胞和红细胞浸润。KO-S组的肺组织结构完整;KO-A组肺组织结构清晰,但可见肺泡间隔稍增宽,炎症细胞浸润少量浸润;KO-IR组和KO-B组肺组织结构受损严重,肺泡间隔增宽,肺泡内充满炎性细胞和红细胞,且观察到炎性细胞聚集成团。各组大鼠病理损伤评分:WT-IR、WT-A和WT-B三组的病理损伤评分都高于WT-S组(P<0.05),WT-A组损伤评分明显低于WT-IR和WT-B组(P<0.05)。WT-IR和WT-B组病理损伤评分无明显差异(P>0.05)。KO大鼠各组病理损伤评分变化趋势与WT组一致。WT和KO大鼠病理损伤评分的比较:KO-IR、KO-A和KO-B组的病理损伤评分分别高于WT-IR、WT-A和WT-B组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)各组大鼠肺组织电镜结果:WT-S组和KO-S组肺泡II型上皮细胞(AECII)整体轮廓清楚,界限清晰,细胞胞质内可见结构完好的嗜锇性板层小体,线粒体无肿胀。在WT-IR组和WT-B组电子显微镜下,观察到AECII板层结构视野数减少,线粒体出现水肿,AECII出现细胞器的损伤。KO-IR组和KO-B组电镜下可见肺泡II型细胞数量较WT-IR组减少,并观察到出现AECII坏死,细胞膜结构破坏,肺泡腔内出现细胞碎片,特异性结构板层小体的平行排列板消失,线粒体肿胀明显,膜外可见残余的绒毛结构。WT-A组电镜下见板层小体结构基本完好,未见线粒体肿胀;KO-A组电镜下可见肺泡II型上皮细胞的结构膜完好,未观察到坏死,胞内板层小体数量减少,线粒体未见肿胀。CPB后KO大鼠AECII的破坏比WT大鼠严重。(5)各组大鼠T3时刻肺组织TNF-α的含量:与WT-S组比较,WT-IR、WT-A、WT-B组肺组织TNF-α含量明显增加(P<0.05);WT-A组TNF-α含量明显低于WT-IR和WT-B组(P<0.05);WT-IR和WT-B组TNF-α含量差异无统计学意义(P>0.05)。KO大鼠各组肺组织TNF-α的含量的变化趋势与WT大鼠相同。WT大鼠和KO大鼠肺组织TNF-α含量的比较:KO-IR、KO-A和KO-B组肺组织TNF-α的含量分别高于WT-IR、WT-A和WT-B组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(6)各组大鼠肺组织中性粒细胞凋亡情况的比较:WT-S组仅观察到少量中性粒细胞,未发现凋亡的中性粒细胞。WT-A组中性粒细胞的凋亡率显著高于WT-IR组和WT-B组(P<0.05)。WT-IR组和WT-B组的凋亡率无明显差异(P>0.05)。KO-S组同样未观察到凋亡的中性粒细胞,其余各组中性粒细胞的凋亡率变化趋势与WT大鼠相同。WT大鼠和KO大鼠肺组织中性粒细胞凋亡率的比较:KO大鼠中KO-IR、KO-A和KO-B组肺组织中性粒细胞凋亡率分别明显低于WT-IR、WT-A和WT-B组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)各组大鼠肺组织中Anx A1和ICAM-1的表达变化:膜联蛋白的Western blot结果显示出双条带(37KD和33KD):WT-IR、WT-A和WT-B组肺组织中Anx A1(37KD和33KD)表达较WT-S组明显增加(P<0.05),而WT-A组Anx A1(37KD和33KD)的表达低于WT-IR和WT-B组(P<0.05)。WT-IR和WT-B组Anx A1(37KD和33KD)的表达差异无统计学意义(P>0.05)。KO组大鼠因为敲除了相关基因,肺组织中并未检测到Anx A1的表达。各组大鼠肺组织中ICAM-1的表达:与WT-S组比较,WT-IR、WT-A和WT-B组肺组织中ICAM-1的表达明显增加(P<0.05),WT-A组ICAM-1的表达低于WT-IR和WT-B组(P<0.05)。WT-IR和WT-B组ICAM-1的表达差异无统计学意义(P>0.05)。KO大鼠各组ICAM-1的表达变化趋势同WT大鼠。WT大鼠和KO大鼠肺组织中ICAM-1表达的比较:KO-IR组和KO-B组ICAM-1的表达分别较WT-IR和WT-B组明显增加(P<0.05),而KO-A组中ICAM-1的表达和WT-A组无统计学差异(P>0.05)。结论:(1)Anx A1基因敲除型大鼠CPB后肺损伤较野生型大鼠明显加重,内源性的AnxA1有明显的抗炎作用。(2)应用外源性膜联蛋白A1模拟肽Ac2-26可减轻野生型大鼠和Anx A1基因敲除型大鼠肺组织炎症反应及肺组织损伤,改善大鼠CPB后的肺功能,对肺有一定的保护作用。但对基因敲除型大鼠CPB肺损伤的保护效果比野生型大鼠差。(3)Anx A1模拟肽Ac2-26减轻CPB肺损伤的机制可能是通过调节大鼠肺组织Anx A1的表达或直接与FPR受体结合,降低大鼠肺组织内TNF-α的含量,抑制ICAM-1表达和促进中性粒细胞凋亡有关。