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毒蘑菇是我国食物中毒导致死亡的最主要毒源之一,在引起死亡的蘑菇中毒事件中有90%与鹅膏菌种类有关。致命鹅膏(Amanita exitialis Zhu L.Yang&T.H.Li)是发现于我国广东的一种剧毒蘑菇,自2000年起已引起误食中毒死亡达20人。本文目的是比较系统地研究致命鹅膏的毒素含量与分布,毒素的分离、纯化与鉴定,灵芝水提物对α-鹅膏毒肽(α-amanitin,α-AMA)引起的小鼠肝损伤的保护作用并探讨其抗氧化特征相关的保护机制,α-和β-鹅膏毒肽(β-amanitin,β-AMA)对人肝细胞系L02细胞生活力及其凋亡的影响。研究结果如下:1、利用反相高效液相色谱检测分析了致命鹅膏不同组织部位[菌褶、菌肉、菌柄、菌环、菌托和孢子]的α-和β-AMA的含量。结果显示,α-和β-AMA在子实体不同组织部位中的分布存在明显差异。菌褶和菌肉中的毒素含量最高总毒素含量分别为5446.2 ±163.9和4907.0 ±155.9μg·-1干组织,而菌托和孢子中的总毒素含量最低,分别为801.1 ± 10.5和392.2±12.3μg·g-1干组织,分别为菌褶中的约1/7和1/14。α-和β-AMA两种鹅膏毒素的相对含量在菌褶、菌盖、菌柄和菌环中比较接近,但在孢子中α-AMA含量只有β-AMA的一半。2、测定了不同发育时期致命鹅膏子实体(A:菌蕾,B:外菌幕破裂的菌蕾,C:菌盖刚从外菌幕中伸出,D:菌柄处于伸长期,E:菌盖展开但内菌幕完整,F:完全成熟的子实体,G:成熟衰老期)中α-和β-AMA含量的变化。结果显示:在致命鹅膏子实体发育各时期α-和β-AMA的含量有变化,特别在成熟衰老阶段。其中,A-D阶段子实体中的毒素含量相对稳定且维持在较高的水平,而在E时期毒素含量达最高值,为4204.0±137.3μg·g1干子实体。而进入到成熟期以后,毒素含量迅速下降,在F和G两个时期分别为1904.4±139.5和1152.8±48.8μg·g-1 干子实体。3、对采集于我国广东广州市区及周边共四个地点(广州市白云山公园南门附近、广州市白云山公园西门附近、华南植物园、华南农业大学树木园)的致命鹅膏子实体的毒素含量进行了检测分析。结果显示:采集于不同地点的致命鹅膏子实体中的毒素含量有明显差别,其中生长于华南植物园和华南农业大学树木园的致命蘑菇子实体毒素含量较高,分别为3550.6±88.6和3538.5±117.7μg·-1干子实体,而白云山公园两处地点生长的致命蘑菇子实体毒素含量较低,分别为2054.6±57.9 和2304.8±18.5μg·g-1 干子实体。4、比较研究了四种大孔吸附树脂(XAD4、XAD16、XAD7HP、XAD1180)对致命鹅膏中毒素组分的静态吸附与解吸附性能。其中以XAD16的吸附能力最强,同时也有较强的解吸附能力,XAD7HP和XAD1180的吸附能力较低,解吸附能力最强,对毒素的富集能力较差。对四种大孔吸附树脂对致命鹅膏中主要毒素组分的静态吸附与解吸附速率的研究表明:四种树脂都是在开始的0.5小时的吸附速度最快,随后吸附速度下降。其中以XAD4对各组分吸附过程最长;而XAD1180对除α-AMA外的其它组分在0.5小时后就达到了相当高的相对水平,3小时后基本饱和。不同大孔吸附树脂对的解吸附速率也存在较大差异,其中以XAD4和XAD16的解吸附速率较慢;而XAD7HP和XAD1180的解吸附速率较快。对吸附后的柱层析洗脱比较,XAD16对致命鹅膏中的个别毒素组分有一定的分离效果,且甲醇洗脱的分离效果好于乙醇,但其效果还达不到用于制备分离的要求。通过综合比较得出:四种大孔吸附树脂都不能实现对毒素组分的有效分离,但可用作毒素提取中的富集,XAD16最适用于致命鹅膏中毒素组分的吸附富集。5、采用大孔吸附树脂柱层析、葡聚糖凝胶(SephadexLH20)柱层析和半制备HPLC相结合,建立了一套实验室规模分离纯化致命鹅膏中肽类毒素的技术,Sephadex LH20制备α-和β-AMA的得率分别为89.55%和94.07%。并以此技术分离到了五个高纯度毒素组分单体。经质谱、[1H]和[13C]核磁共振技术对这些毒素组分进行分析,鉴定出α-AMA和β-AMA。另外三个根据分子量比对,初步推断为:脱氧二羟毒伞素(desoxoviroidin),竣基三羟鬼笔毒肽[phallisacin(PSC)]和竣基二羟鬼笔毒肽[phallacidin(PCD)]。6.评价了灵芝水提物(GLE)对α-AMA引起的小鼠肝损伤的保护效果,并分析与自由基清除活性相关的肝损伤保护机制。小鼠用由Amαnitαexitiαlis制备的α-AMA染毒,注射α-AMA后用GLE给药,用水飞蓟宾(SIL)作参考比较GLE的护肝活性。α-AMA能引起血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性的显著升高,显著降低超氧歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,并显著增加肝脏匀浆中MDA含量。与α-AMA对照组相比,用GLT和SIL治疗能显著降低血清中的ALT和AST水平,显著增加SOD和CAT活性,降低肝脏中MDA含量。肝脏切片的组织病理学检查结果与生化指标的参数变化相一致。结果证实GLE对由α-AMA引起的肝损伤具有很好的保护效果,其保护机理之一与其抗氧化特征相关。7、研究了不同浓度α-和β-AMA对人肝细胞株L02的活力的影响。结果显示:1μM以上浓度的α-和β-AMA都能抑制肝细胞生活力,并且抑制率随着浓度的增加而升高。8、利用荧光染料hoechst33342和碘化丙啶(PI)染色观察分析了不同浓度α-和β-AMA以及不同时间处理后肝细胞的凋亡情况。结果表明2μM以上浓度的α-和β-AMA都能诱导L02细胞凋亡,并且存在浓度依赖效应。5μM以上浓度的α-AMA在共培养12小时后L02细胞中还出现明显的坏死,浓度越高,坏死现象越明显。10μM以上浓度的β-AMA在共培养12小时后L02细胞中也出现明显细胞坏死。发生凋亡的L02细胞的染色质性浓缩与边缘化,这种浓缩与边缘化不断加强,后出现核的碎裂与崩解。9.利用DNALadder凝胶电泳检测分析了 α-和β-AMA处理L02细胞后肝细胞的凋亡情况。结果表明:,5μM以上浓度的α-和β-AMA处理24小时都能诱导LO2细胞DNA片段化。随两种鹅膏毒肽浓度的增大,所提取到的L02细胞中的完整DNA量减少,表明随鹅膏毒肽浓度的增大,引起了 L02细胞损伤的同时发生了 DNA降解。10.检测分析了鹅膏毒肽对细胞凋亡关键因子caspase3,8,9的活性影响,结果表明:1μM以上浓度的两种鹅膏毒肽都能引起这3种caspase酶活性显著升高,尤其是caspase3。这说明两种鹅膏毒肽都启动了 L02细胞依赖于caspase3的凋亡过程。