【摘 要】
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第一部分在胃癌细胞中,5-FU阻断PKCδ介导的HuR穿梭目的:在本研究中,我们旨在研究5-FU在SGC细胞系中调控的PKCδ的表达及HuR穿梭的机制。方法:用胃癌化疗药物5-FU处理胃癌细胞,用Western Blot（WB）和细胞免疫荧光两种方法检测胃癌细胞总HuR和调控HuR核质穿梭的PKCδ的蛋白含量,以及胃癌细胞细胞质与细胞核中HuR的蛋白表达情况;用PKC抑制剂和PKCδsiRNA处理
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第一部分在胃癌细胞中,5-FU阻断PKCδ介导的HuR穿梭目的:在本研究中,我们旨在研究5-FU在SGC细胞系中调控的PKCδ的表达及HuR穿梭的机制。方法:用胃癌化疗药物5-FU处理胃癌细胞,用Western Blot（WB）和细胞免疫荧光两种方法检测胃癌细胞总HuR和调控HuR核质穿梭的PKCδ的蛋白含量,以及胃癌细胞细胞质与细胞核中HuR的蛋白表达情况;用PKC抑制剂和PKCδsiRNA处理胃癌细胞,用WB和细胞免疫荧光两种方法检测胃癌细胞细胞质与细胞核中HuR的蛋白表达情况;分别用HuR和PKCδ siRNA处理胃癌细胞,下调相应的基因表达以后,用MTT法检测胃癌细胞增殖变化。分别构建了过表达野生型HuR的质粒,HuR的219位点突变的质粒,以及HuR316位点突变的质粒,并将这些质粒和不表达HuR的pcDNA3.1质粒转染胃癌细胞,用MTT法检测胃癌细胞的细胞增殖情况。结果:（1）5-FU不影响胃癌细胞中总的HuR和PKCδ蛋白水平,但可以阻断胃癌细胞中HuR从细胞核到细胞质的穿梭过程。（2）抑制PKCδ也可以抑制胃癌细胞中HuR从细胞核到细胞质的穿梭过程。（3）降低HuR表达后胃癌细胞的增殖减少。（4）敲降PKCδ表达不影响胃癌细胞的增殖。（5）PKCδ通过磷酸化HuR的Ser219和Ser316位点,促进HuR的核质穿梭,当这些HuR位点突变后,胃癌细胞增殖减少。结论:在胃癌细胞中,5-FU通过阻断PKCδ介导的HuR出核来抑制胃癌细胞增殖。第二部分在斑马鱼中,HuR对胃癌细胞肿瘤凋亡的影响目的:在本研究中,我们用斑马鱼肿瘤异种移植模型,研究HuR的表达对胃癌细胞肿瘤特性的影响。方法:构建带GFP的稳转胃癌细胞系,分别敲降HuR和PKCδ,通过显微注射将胃癌细胞异种移植到野生型斑马鱼2dpf的胚胎中,观察能稳定表达绿色荧光蛋白的胃癌细胞在斑马鱼幼鱼中的成瘤情况,包括体内肿瘤细胞增殖、血管生成和转移活性;利用CRISPR/Cas9技术构建hur-/-突变体,用TUNEL法检测2dpf斑马鱼幼鱼的凋亡情况,用p-histone3检测胚胎的增殖情况。结果:（1）敲降HuR和PKCδ的胃癌细胞在野生型斑马鱼胚胎中生长受限（2）hur-/-突变体胚胎神经系统增殖增强,凋亡减少。结论:敲降HuR和PKCδ使得胃癌细胞在斑马鱼胚胎中成瘤情况不佳。
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