第一部分Cu²⁺在Hcy损害内皮细胞中的作用目的:探讨Cu²⁺在Hcy损害内皮细胞中的作用。方法:体外提取培养原代人脐静脉内皮细胞以及原代小鼠主动脉内皮细胞,免疫荧光以及流式细胞术鉴定内皮细胞CD31表型。Hcy、Cu²⁺、Hcy联合Cu²⁺/Fe²⁺/Mg²⁺/Ca²⁺、Hcy联合Cu²⁺及铜离子螯合剂浴铜灵分别处理脐静脉内皮细胞以及主动脉内皮细胞后,MTT检测细胞存活率。结果:单独Hcy、Cu²⁺以及Hcy联合Fe²⁺/Mg²⁺/Ca²⁺对内皮细胞存活率无明显影响,Hcy联合Cu²⁺显著降低内皮细胞存活率;铜离子螯合剂浴铜灵抑制Hcy联合Cu²⁺造成的内皮细胞死亡。结论:Hcy需要在Cu²⁺的参与下损害血管内皮细胞,两者具有协同损伤内皮细胞作用。第二部分Hcy联合Cu²⁺通过ROS和RNS造成内皮细胞凋亡目的:探讨Hcy联合Cu²⁺损伤血管内皮细胞的机制。方法:Hcy联合Cu²⁺处理原代人脐静脉内皮细胞以及原代小鼠主动脉内皮细胞不同时间,流式细胞仪检测细胞内ROS、凋亡细胞、线粒体膜电位及内膜磷脂氧化水平;透射电镜观察细胞及线粒体超微结构;提取总蛋白,western-blot检测caspase3及3-NT表达;分离胞浆,检测细胞色素c在细胞质中表达;Hcy联合Cu²⁺处理小鼠主动脉内皮细胞基础上加入抗氧化物NAC/SOD/Catalase后流式细胞仪检测凋亡细胞、细胞内ROS;western-blot检测3-NT表达。Hcy联合Cu²⁺、H₂O₂及ONOO^-分别处理脐静脉内皮细胞,MTT检测细胞检测细胞存活率。结果:Hcy联合Cu²⁺引起内皮细胞内H₂O₂及ONOO^-升高;Hcy联合Cu²⁺造成原代人脐静脉内皮细胞以及原代小鼠主动脉内皮细胞线粒体损伤,细胞色素c释放到细胞质以及caspase3剪切;caspase抑制剂z VADfmk抑制细胞死亡;透射电镜观察细胞超微结构,显示染色质凝聚,出现凋亡小体;抗氧化物降低小鼠主动脉内皮细胞中H₂O₂和ONOO^-含量,并抑制Hcy联合Cu²⁺诱导的小鼠主动脉内皮细胞凋亡。相同浓度ONOO^-比H₂O₂更显著降低人脐静脉内皮细胞存活率。结论:Hcy联合Cu²⁺诱导内皮细胞产生大量ROS,主要以H₂O₂和ONOO^-为主;Hcy联合Cu²⁺损伤内皮细胞线粒体,诱发线粒体凋亡;ONOO^-可能是介导Hcy联合Cu²⁺引起内皮细胞凋亡的重要自由基类型。第三部分Hcy联合Cu²⁺诱导内皮细胞产生H₂O₂和ONOO^-的机制目的:探讨Hcy联合Cu²⁺诱导内皮细胞产生H₂O₂和ONOO^-的机制。方法:Hcy联合Cu²⁺+/-NADPH处理原代人脐静脉内皮细胞、原代小鼠主动脉内皮细胞不同时间,流式细胞仪检测细胞内ROS、线粒体ROS、线粒体膜电位、线粒体内膜磷脂氧化及细胞内NO水平;分光光度法检测线粒体电子传递链酶复合体、SOD、Catalase活性以及培养基乳酸水平。Clark氧电极测定氧耗率。ATP试剂盒检测细胞内ATP含量。提取总蛋白,Western-blot检测GPx-1,e NOS,i NOS、e NOS单聚体/二聚体表达。分离胞浆以及包膜,化学发光法检测NOX活性。Hcy联合Cu²⁺+/-DPI/VAS2870处理原代人脐静脉内皮细胞、原代小鼠主动脉内皮细胞,MTT检测细胞存活率。结果:Hcy联合Cu²⁺提高原代人脐静脉内皮细胞、原代小鼠主动脉内皮细胞中NOX活性近2000-5000倍,且被NOX抑制剂DPI或者VAS2870所抑制,在Hcy联合Cu²⁺基础加入NADPH引起细胞ROS水平进一步增加以及线粒体膜电位下降。但是NOX抑制剂不能抑制两种内皮细胞死亡,反而增加细胞凋亡;Hcy联合Cu²⁺增加人脐静内皮细胞乳酸合成;Hcy联合Cu²⁺首先快速降低线粒体电子传递链酶复合体Ⅳ的活性;而后降低复合体Ⅰ-Ⅲ的活性,同时伴随线粒体内膜磷脂氧化增加和线粒体膜电位下降、细胞内氧耗率以及ATP含量下降;Hcy联合Cu²⁺引起人脐静脉内皮细胞中e NOS表达以及NO含量先增加后减少,i NOS表达逐渐增加,同时e NOS解偶联。Hcy联合Cu²⁺引起脐静脉内皮细胞中SOD活性增加,降低Catalase活性及下调两种原代内皮细胞GPx-1表达。结论:Hcy联合Cu²⁺通过能量补偿方式提高内皮细胞中NOX活性,进而引起ROS以及RNS增加。