肝癌是全球常见10种恶性肿瘤之一，全球每年约有25万人死于肝癌，我国约占其中40％，还呈逐年上升之势。在以手术切除为主的肝癌综合治疗方案中，化疗是不可缺少的一环。因为肝癌较其他实体肿瘤对化疗更不敏感，所以化疗总体效果不明显。因此，研究提高肝癌细胞对化疗的敏感性，是提高病人生存率的重要策略。 端粒酶是一种逆转录酶，由RNA模板(hTR)和蛋白催化亚基(hTERT)组成，可以合成端粒维持基因组稳定性。其中RNA模板(hTR)为组成性表达，端粒酶活性和蛋白催化亚基(hTERT)的表达呈正相关。研究证实通过端粒酶延长端粒维持基因组稳定性是绝大部分肿瘤细胞逃避凋亡无限增殖所必需的。在本室以前进行的肝癌端粒酶相关研究中，也发现肝癌的端粒酶阳性率为85％，明显高于癌旁组织、肝硬变组织及慢性肝炎组织，而正常肝脏组织没有端粒酶活性，我们认为端粒酶的表达可能在肝癌的发生发展中起到了重要作用。研究者希望通过使用反义核酸特异抑制端粒酶活性治疗肿瘤。但是反义抑制的效率低下，如何寻找一种高效安全的抑制方法成为以端粒酶为靶点肿瘤治疗研究首先要解决的问题。 RNAi是近两年来发现的一种细胞固有的基因沉默的机制。外源或内源的双链(dsRNA)可以触发靶基因转录的同源序列mRNA特异性地降解，从而产生相应的功能表型缺失，这一过程属于转最后基因沉默机制(posttranscriptional gene silienceing，PTGS)。通过细胞内一系列酶的作用，极少的dsRNA就能特异高效的抑制靶基因。腺病毒载体系统感染宿主细胞的范围广泛，对分裂期和非分裂期细胞均可感染，感染效率高，病毒感染过程中不整合到宿主细胞的基因组中，不会引起宿主细胞的插入突变，遗传学稳定性高，可获得比较高的病毒滴度。 我们利用腺病毒的高感染率和RNAi的高抑制率使细胞的端粒酶活性抑制，然后应用细胞及分子生物学技术，观察端粒酶抑制后细胞生长变化及对化疗敏感性的变化。 本实验主要有三部分组成：第二军医大学硕士论文1.表达si/hTERT腺病毒载体的构建及制备 本实验研究利用pSUPER一EGFP载体与pAd一Easy系统构建了RNA干扰端粒酶腺病毒载体，命名为Ad一si爪TERT。把化学合成的寡聚核普酸连入用Bgln+Hind111酶切的pSUpER一EGFp载体，命名为pSUpER一51爪TERT。将pSUpER一51小TERT用EeoRI+Hind 111酶切，回收目的片段与用EcoRI+Hind 111双酶切后pCDNA3.1+载体片段连接。再经Hind工H+X ba工双酶切鉴定正确后，将回收含有目的基因片段与用HindH工+Xba工双酶切后的TRACK载体片段连接，构建成TRACK一si/hTERT质粒。经Pmel酶切后与Ad一Easy同源重组，重组质粒用Pacl酶切，转入293细胞内包装扩增，经氯化艳梯度离心后，获得10’“PuF/ml病毒滴度的病毒悬液，一80℃冻存待用。2.Ad一s盯hTERT腺病毒增强肝癌细胞化疗敏感性体外实验研究 本实验主要验证Ad一si爪TERT腺病毒增强肝癌细胞化疗敏感性体外作用。通过荧光显微镜观察发现腺病毒可高效感染肝癌细胞株7721。经R丁’- pCR、Westemblot、银染一TRAP等方法证实，腺病毒Ad一si爪TERT可有效的抑制肝癌细胞株7721中端粒酶的表达及活性。但测定端粒酶抑制后短期内细胞的生长曲线没有太大变化且凋亡率不高。用MT’T法和流式细胞仪观察到顺铂对肝癌细胞株7721的生长阻滞作用非常明显，但无明显凋亡。进一步的实验证实，经Ad一si小TERT腺病毒抑制肝癌细胞株7721的端粒酶活性后，用顺铂化疗可出现大量凋亡;而对照组的凋亡却不明显。实验结果说明，通过Ad一si爪TERI，腺病毒能在体外增强肝癌细胞化疗敏感性。3.Ad一s盯hTERT腺病毒增强肝癌细胞化疗敏感性体内实验研究 上述实验证实，经Ad一si小TERT腺病毒感染的肝癌细胞株7721对顺铂化疗的敏感性明显增强。进而进行动物实验，在BALB/C小鼠上接种7721肝癌细胞成瘤，可观察Ad一si爪TERT腺病毒联合顺铂化疗的疗效。我们将实验组肿瘤生长曲线与未处理，Ad一si小TERT腺病毒处理，顺铂处理对照组对比后发现，实验组肿瘤的体积增长比对照组明显要慢。，经可重复测量的双因素方差分析表明差异显著。从组织切片HE染色也能看出实验组有明显的坏死而对照组没有。实验结果说明，Ad一si爪TERT腺病毒能在体内增强肝癌细胞化疗敏感性。