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蜡蚧轮枝菌VL17菌株是沈阳农业大学农药科学实验室筛选出的对温室白粉虱和蚜虫具有高致病力的菌株。本试验以VL17菌株为主要研究对象,对其液体发酵条件、最佳发酵培养液、毒素粗提物的纯化分离及对温室白粉虱的作用机制进行了系统的研究,明确了VL17菌株液体发酵的最适培养基为Czapek,250mL摇瓶发酵的最佳培养条件为添加酵母浸膏的120mL培养液于28℃200r·min<-1>下培养5d,分离出了5种活性成分,得到了对温室白粉虱有较高生物活性的杀虫毒素,初步研究毒素的作用机制为触杀性神经毒剂。本试验的研究结果为将VL17菌株杀虫毒素开发成为新型的天然产物农药奠定了理论基础。
本文采用正交试验方法,利用国产HZQ-F160型全温振荡培养箱,在250mL摇瓶中对蜡蚧轮枝菌VL17菌株进行液体发酵条件的优化及培养液种类的筛选。结果显示:用不同培养液做基质时,各个发酵条件因子对VL17菌株发酵水平的影响能力不同。综合比较后发现,在250mL摇瓶中用Czapek恒温震荡培养蜡蚧轮枝菌VL17菌株时,装入120mL培养液,添加一定量的酵母浸膏(10 g·L<-1>),在28℃200r·min<-1>条件下培养5d即可产生最大量的毒素粗提物。该菌株无论在发酵性能还是杀虫毒力上均是一株比较优良昆虫病原真菌,有进一步研究应用的价值。因此,本试验将进一步对VL17菌株的毒素粗提物作以研究。
在对蜡蚧轮枝菌VL17菌株的毒素粗提物分离和纯化的研究中,主要采取了薄层层析与柱层析交叉使用的方法,对毒素粗提物边分离边进行检测。研究结果表明,用石油醚:乙酸乙酯=40:1的比例配制洗脱剂分别对VL17菌株胞外粗提物和胞内粗提物进行分离纯化,获得了5种胞外毒素成分和1种胞内毒素成分,并且胞内毒素与胞外毒素的其中一个成分为同一种产物。对5种组分分别对温室白粉虱的成虫和若虫做生物测定,发现3号和4号组分对温室白粉虱成虫的8h校正死亡率在70%以上,LC<,50>分别为0.29mg·mL<-1>和0.48 mg·mL<-1>,而3号组分对温室白粉虱1龄若虫的校正死亡率也在70%以上,LC<,50>值为0.16 mg·mL<-1>。
在对蜡蚧轮枝菌VL17菌株作用机制的研究中,主要参照了Ellman(1961)和孙耕芹(1987)以及Van Asperene(1962)和郑炳宗(1988)的方法,测定了杀虫毒素对温室白粉虱成虫和若虫的离体乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的影响。结果显示,蜡蚧轮枝菌VL17菌株杀虫毒素对温室白粉虱成虫和若虫的离体乙酰胆碱酯酶活性都有极显著的抑制作用,毒素处理4h后酶活抑制率分别高达90.8%和54.0%,毒素对乙酰胆碱酯酶的强烈抑制作用可能是致死温室白粉虱的主要原因。而VL17菌株杀虫毒素对温室白粉虱成虫和若虫离体羧酸酯酶的抑制率极低,仅达到了1.9%和18.0%,基本上没有表现出抑制作用,对羧酸酯酶的抑制可能不是害虫致死的原因。本试验分离得到了对温室白粉虱有较高毒力的蜡蚧轮枝菌VL17菌株杀虫毒素活性成分。在今后的研究工作中,可以采用紫外光谱法、红外光谱法、核磁共振法以及质谱法等先进的研究技术,鉴定出蜡蚧轮枝菌VL17菌株杀虫毒素的化学结构,为天然产物的人工仿生合成提供理论依据。