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目的：
通过临床观察比较苍膝通痹胶囊与痹祺胶囊在治疗KOA上的差异，明确苍膝通痹胶囊治疗KOA的临床疗效；并通过体内实验联合体外实验的方法探讨KOA的发病机理及苍膝通痹胶囊的作用机制，阐明KOA的发病与p38MAPK信号通路的相关性及苍膝通痹胶囊能否靶向抑制p38MAPK信号通路保护关节软骨。
方法：
第一部分临床研究：根据本研究的诊断标准及纳排标准，将2017年9月至2018年9月我院收治的60例DavidⅠ～Ⅱ期KOA患者，按随机数字表法随机分为苍膝通痹胶囊组(A组)和痹祺胶囊组(B组)，每组30例，分别给予相应的药物治疗2个月。定期随访，于治疗前、治疗后2周、治疗后1月、治疗后2月根据疼痛视觉模拟评分标准、骨关节指数WOMAC评分标准以及Lequesne指数评分标准进行评分。
第二部分体外细胞实验：两步酶消化法分离提取1周龄SD大鼠膝关节软骨细胞，采用甲苯胺蓝染色法及Ⅱ型胶原免疫组化法进行鉴定，培养至第2代，用10ng/ml的IL-1β诱导24h，建立退变关节软骨细胞模型作为研究对象。高效液相色谱法测定苍膝通痹胶囊干粉中独活有效成分蛇床子素的含量，CCK-8法筛选最佳药物作用浓度。将细胞分为空白组(KB)、模型组(MX)、DMSO组(DM)、苍膝通痹胶囊组(CX)、p38MAPK信号通路阻断剂SB203580组(SB)、苍膝通痹胶囊与SB203580共培养组(CS)。建模成功后，KB组与MX组正常培养，DM组用含0.1%DMSO的完全培养基培养，CX组用含100μg/ml苍膝通痹胶囊的完全培养基培养，SB组用含10μMSB203580的完全培养基培养，CS组用含100μg/ml苍膝通痹胶囊和10μMSB203580的完全培养基培养。培养干预24h后，收集细胞及上清液。流式细胞技术检测细胞凋亡情况，Elisa法检测IL-1β、TNF-α表达水平，WesternBlot法检测p38MAPK信号通路中相关蛋白p38、p-p38、MMP13、CollagenⅡ的表达水平，RT-PCR法检测p38MAPK信号通路中相关基因p38mRNA、MMP13mRNA、CollagenⅡmRNA的表达水平，免疫组化法检测p-p38表达水平。
第三部分体内动物实验：将60只4周龄SPF级健康雄性SD大鼠，按随机数字表法随机分为六组：空白组(KB)、模型组(MX)、DMSO组(DM)、苍膝通痹胶囊组(CX)、SB203580组(SB)以及苍膝通痹胶囊联合SB203580组(CS)，每组10只。除正常组外，其余各组采用改良Hulth法建立KOA模型，X线显示造模成功后，根据Meeh-Rubner体表面积计算公式计算给药量，CX组每日给予35mg/ml苍膝通痹胶囊溶液灌胃，SB组每日给予2mg/ml的SB203580溶液灌胃，CS组每日给予含2mg/mlSB203580及35mg/ml苍膝通痹胶囊的混合溶液灌胃，DM组给予1%的DMSO溶液灌胃，MX组和KB组给予生理盐水灌胃，灌胃量均为3ml，每日一次。用药干预4周后处死、取材。HE染色法观察软骨组织形态学改变，Elisa法检测外周血上清液中IL-1β、TNF-α表达水平，WesternBlot法检测关节软骨组织中p38MAPK信号通路中相关蛋白p38、p-p38、MMP13、CollagenⅡ的表达水平，RT-PCR法检测p38MAPK信号通路中相关基因p38mRNA、MMP13mRNA、CollagenⅡmRNA的表达水平，免疫组化法检测p-p38表达水平。
结果：
第一部分临床研究：1、治疗2周、1月、2月后两组患者均取得了满意的疗效，其中治疗2周后A组总有效率较B组高16.63%，差异有统计学意义(P＜0.05)，但是治疗1月、2月后A组总有效率较B组分别高6.70%、3.37%，差异无显著统计学意义(P＞0.05)。2、治疗2周、1月、2月后，两组患者VAS评分、Lequesne指数和WOMAC评分较治疗前均明显降低，同组治疗前后比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；治疗2周后A组患者VAS评分、Lequesne指数和WOMAC评分优于B组，差异有统计学意义(P＜0.05)；治疗1月、2月后两组患者VAS评分、Lequesne指数和WOMAC评分没有明显差异(P＞0.05)。3、两组患者治疗过程中均未出现过敏、皮疹以及恶心、呕吐等消化系统不良反应情况，药物安全等级均为Ⅰ级。
第二部分体外细胞实验：1、苍膝通痹胶囊干粉中独活有效成分蛇床子素的含量为0.1404mg/g。2、苍膝通痹胶囊浓度在400μg/ml以下时，不影响大鼠膝关节软骨细胞的活力，是安全干预浓度范围；其中对于IL-1β诱导退变关节软骨细胞的最佳作用浓度为100μg/ml。3、MX组凋亡率明显高于KB组(P＜0.05)，DM组凋亡率与MX组大致相同(P＞0.05)，CX组、SB组、CS组凋亡率均显著降低(P＜0.05)。4、KB组炎性因子IL-1β、TNF-α的表达水平最低，MX组表达水平最高，且二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组炎性因子表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者无明显差异(P＞0.05)；CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞炎性因子的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，炎性因子表达水平降低最多，差异有统计学意义(P＜0.05)。5、KB组CollagenⅡ的表达水平最高，MMP13、P38、P-P38的表达水平最低，与MX组相比二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组蛋白表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者无明显差异(P＞0.05)，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞MMP13、P38、P-P38的表达，同时升高CollagenⅡ的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，蛋白表达水平改变最多，差异有统计学意义(P＜0.05)。6、KB组CollagenⅡmRNA的表达水平最高，MMP13mRNA、P38mRNA的表达水平最低，与MX组相比二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组基因表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者无明显差异(P＞0.05)，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞MMP13mRNA、P38mRNA的表达，同时升高CollagenⅡmRNA的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，基因表达水平改变最多，差异有统计学意义(P＜0.05)。7、KB组p-p38的表达水平最低，MX组表达水平最高；与MX组蛋白表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞P-P38的表达。
第三部分体内动物实验：1、与KB组相比，MX、DM组关节软骨颜色明显变浑浊，表面粗糙，HE染色显示软骨细胞数目减少，排列不规则，层次不清晰，结构紊乱，有新生血管翳；CX组、SB组以及CS组关节软骨颜色虽有颜色的改变，但没有MX组明显，HE染色显示软骨细胞数目减少，排列欠规则，层次欠清晰，结构稍紊乱，但是CS组优于SB组优于CX组。2、KB组炎性因子IL-1β、TNF-α的表达水平最低，MX组表达水平最高，且二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组炎性因子表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者无明显差异(P＞0.05)；CX组、SB组以及CS组均可以有效降低大鼠外周血中炎性因子的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，炎性因子表达水平降低最多，差异有显著统计学意义(P＜0.05)。3、KB组CollagenⅡ的表达水平最高，MMP13、P38、P-P38的表达水平最低，与MX组相比二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组蛋白表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者比较无明显统计学差异(P＞0.05)，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞MMP13、P38、P-P38的表达，同时升高CollagenⅡ的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，蛋白表达水平改变最多，差异有统计学意义(P＜0.05)。4、KB组CollagenⅡmRNA的表达水平最高，MMP13mRNA、P38mRNA的表达水平最低，与MX组相比二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组基因表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者无明显差异(P＞0.05)，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞MMP13mRNA、P38mRNA的表达，同时升高CollagenⅡmRNA的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，基因表达水平改变最多，差异有显著统计学意义(P＜0.05)。5、KB组p-p38的表达水平最低，MX组表达水平最高；与MX组蛋白表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞P-P38的表达。
结论：
1.苍膝通痹胶囊可以明显缓解KOA患者的疼痛、肿胀以及关节功能障碍等症状，与痹祺胶囊相比，具有起效快、疗效更可靠等优势，值得临床推广；2.p38MAPK信号通路在KOA病理进展中的发挥着重要的调节作用，是KOA发病的重要通路，也是KOA防治的重要靶点；3.苍膝通痹胶囊可以靶向阻断p38MAPK信号通路来促进退变软骨细胞的修复，保护关节软骨细胞。
通过临床观察比较苍膝通痹胶囊与痹祺胶囊在治疗KOA上的差异，明确苍膝通痹胶囊治疗KOA的临床疗效；并通过体内实验联合体外实验的方法探讨KOA的发病机理及苍膝通痹胶囊的作用机制，阐明KOA的发病与p38MAPK信号通路的相关性及苍膝通痹胶囊能否靶向抑制p38MAPK信号通路保护关节软骨。
方法：
第一部分临床研究：根据本研究的诊断标准及纳排标准，将2017年9月至2018年9月我院收治的60例DavidⅠ～Ⅱ期KOA患者，按随机数字表法随机分为苍膝通痹胶囊组(A组)和痹祺胶囊组(B组)，每组30例，分别给予相应的药物治疗2个月。定期随访，于治疗前、治疗后2周、治疗后1月、治疗后2月根据疼痛视觉模拟评分标准、骨关节指数WOMAC评分标准以及Lequesne指数评分标准进行评分。
第二部分体外细胞实验：两步酶消化法分离提取1周龄SD大鼠膝关节软骨细胞，采用甲苯胺蓝染色法及Ⅱ型胶原免疫组化法进行鉴定，培养至第2代，用10ng/ml的IL-1β诱导24h，建立退变关节软骨细胞模型作为研究对象。高效液相色谱法测定苍膝通痹胶囊干粉中独活有效成分蛇床子素的含量，CCK-8法筛选最佳药物作用浓度。将细胞分为空白组(KB)、模型组(MX)、DMSO组(DM)、苍膝通痹胶囊组(CX)、p38MAPK信号通路阻断剂SB203580组(SB)、苍膝通痹胶囊与SB203580共培养组(CS)。建模成功后，KB组与MX组正常培养，DM组用含0.1%DMSO的完全培养基培养，CX组用含100μg/ml苍膝通痹胶囊的完全培养基培养，SB组用含10μMSB203580的完全培养基培养，CS组用含100μg/ml苍膝通痹胶囊和10μMSB203580的完全培养基培养。培养干预24h后，收集细胞及上清液。流式细胞技术检测细胞凋亡情况，Elisa法检测IL-1β、TNF-α表达水平，WesternBlot法检测p38MAPK信号通路中相关蛋白p38、p-p38、MMP13、CollagenⅡ的表达水平，RT-PCR法检测p38MAPK信号通路中相关基因p38mRNA、MMP13mRNA、CollagenⅡmRNA的表达水平，免疫组化法检测p-p38表达水平。
第三部分体内动物实验：将60只4周龄SPF级健康雄性SD大鼠，按随机数字表法随机分为六组：空白组(KB)、模型组(MX)、DMSO组(DM)、苍膝通痹胶囊组(CX)、SB203580组(SB)以及苍膝通痹胶囊联合SB203580组(CS)，每组10只。除正常组外，其余各组采用改良Hulth法建立KOA模型，X线显示造模成功后，根据Meeh-Rubner体表面积计算公式计算给药量，CX组每日给予35mg/ml苍膝通痹胶囊溶液灌胃，SB组每日给予2mg/ml的SB203580溶液灌胃，CS组每日给予含2mg/mlSB203580及35mg/ml苍膝通痹胶囊的混合溶液灌胃，DM组给予1%的DMSO溶液灌胃，MX组和KB组给予生理盐水灌胃，灌胃量均为3ml，每日一次。用药干预4周后处死、取材。HE染色法观察软骨组织形态学改变，Elisa法检测外周血上清液中IL-1β、TNF-α表达水平，WesternBlot法检测关节软骨组织中p38MAPK信号通路中相关蛋白p38、p-p38、MMP13、CollagenⅡ的表达水平，RT-PCR法检测p38MAPK信号通路中相关基因p38mRNA、MMP13mRNA、CollagenⅡmRNA的表达水平，免疫组化法检测p-p38表达水平。
结果：
第一部分临床研究：1、治疗2周、1月、2月后两组患者均取得了满意的疗效，其中治疗2周后A组总有效率较B组高16.63%，差异有统计学意义(P＜0.05)，但是治疗1月、2月后A组总有效率较B组分别高6.70%、3.37%，差异无显著统计学意义(P＞0.05)。2、治疗2周、1月、2月后，两组患者VAS评分、Lequesne指数和WOMAC评分较治疗前均明显降低，同组治疗前后比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；治疗2周后A组患者VAS评分、Lequesne指数和WOMAC评分优于B组，差异有统计学意义(P＜0.05)；治疗1月、2月后两组患者VAS评分、Lequesne指数和WOMAC评分没有明显差异(P＞0.05)。3、两组患者治疗过程中均未出现过敏、皮疹以及恶心、呕吐等消化系统不良反应情况，药物安全等级均为Ⅰ级。
第二部分体外细胞实验：1、苍膝通痹胶囊干粉中独活有效成分蛇床子素的含量为0.1404mg/g。2、苍膝通痹胶囊浓度在400μg/ml以下时，不影响大鼠膝关节软骨细胞的活力，是安全干预浓度范围；其中对于IL-1β诱导退变关节软骨细胞的最佳作用浓度为100μg/ml。3、MX组凋亡率明显高于KB组(P＜0.05)，DM组凋亡率与MX组大致相同(P＞0.05)，CX组、SB组、CS组凋亡率均显著降低(P＜0.05)。4、KB组炎性因子IL-1β、TNF-α的表达水平最低，MX组表达水平最高，且二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组炎性因子表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者无明显差异(P＞0.05)；CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞炎性因子的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，炎性因子表达水平降低最多，差异有统计学意义(P＜0.05)。5、KB组CollagenⅡ的表达水平最高，MMP13、P38、P-P38的表达水平最低，与MX组相比二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组蛋白表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者无明显差异(P＞0.05)，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞MMP13、P38、P-P38的表达，同时升高CollagenⅡ的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，蛋白表达水平改变最多，差异有统计学意义(P＜0.05)。6、KB组CollagenⅡmRNA的表达水平最高，MMP13mRNA、P38mRNA的表达水平最低，与MX组相比二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组基因表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者无明显差异(P＞0.05)，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞MMP13mRNA、P38mRNA的表达，同时升高CollagenⅡmRNA的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，基因表达水平改变最多，差异有统计学意义(P＜0.05)。7、KB组p-p38的表达水平最低，MX组表达水平最高；与MX组蛋白表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞P-P38的表达。
第三部分体内动物实验：1、与KB组相比，MX、DM组关节软骨颜色明显变浑浊，表面粗糙，HE染色显示软骨细胞数目减少，排列不规则，层次不清晰，结构紊乱，有新生血管翳；CX组、SB组以及CS组关节软骨颜色虽有颜色的改变，但没有MX组明显，HE染色显示软骨细胞数目减少，排列欠规则，层次欠清晰，结构稍紊乱，但是CS组优于SB组优于CX组。2、KB组炎性因子IL-1β、TNF-α的表达水平最低，MX组表达水平最高，且二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组炎性因子表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者无明显差异(P＞0.05)；CX组、SB组以及CS组均可以有效降低大鼠外周血中炎性因子的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，炎性因子表达水平降低最多，差异有显著统计学意义(P＜0.05)。3、KB组CollagenⅡ的表达水平最高，MMP13、P38、P-P38的表达水平最低，与MX组相比二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组蛋白表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者比较无明显统计学差异(P＞0.05)，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞MMP13、P38、P-P38的表达，同时升高CollagenⅡ的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，蛋白表达水平改变最多，差异有统计学意义(P＜0.05)。4、KB组CollagenⅡmRNA的表达水平最高，MMP13mRNA、P38mRNA的表达水平最低，与MX组相比二者有显著性差异(P＜0.05)；与MX组基因表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，二者无明显差异(P＞0.05)，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞MMP13mRNA、P38mRNA的表达，同时升高CollagenⅡmRNA的表达(P＜0.05)，但是苍膝通痹胶囊与p38MAPK信号通路阻断剂联合应用时，基因表达水平改变最多，差异有显著统计学意义(P＜0.05)。5、KB组p-p38的表达水平最低，MX组表达水平最高；与MX组蛋白表达水平相比，DM组与其表达水平大致相同，CX组、SB组以及CS组均可以有效降低退变软骨细胞P-P38的表达。
结论：
1.苍膝通痹胶囊可以明显缓解KOA患者的疼痛、肿胀以及关节功能障碍等症状，与痹祺胶囊相比，具有起效快、疗效更可靠等优势，值得临床推广；2.p38MAPK信号通路在KOA病理进展中的发挥着重要的调节作用，是KOA发病的重要通路，也是KOA防治的重要靶点；3.苍膝通痹胶囊可以靶向阻断p38MAPK信号通路来促进退变软骨细胞的修复，保护关节软骨细胞。