背景与目的:骨折愈合、骨缺损重建以及脊柱融合相关问题的研究一直是备受骨科医生关注的领域。尽管自体骨在骨融合手术中被常规应用,但仍存在诸多局限性,包括骨移植物来源有限,取骨区可能发生疼痛、出血、骨折等并发症以及因并发症导致手术费用的增加,因而亟需一种替代性的方法应用于骨缺损的修复及骨再生领域。1965年Marshall Urist在将活骨植入动物模型后观察诱导新骨生成能力时发现了骨形成蛋白(BMPs)。1988年,Wang等人在骨组织的纯化提取物及其重组产物中分离得到了BMP-2。随着生物技术的进步,BMPs受到广泛研究并应用到临床领域。此后,大量的体外实验、动物实验以及临床试验验证了BMP-2促进骨愈合及骨再生的效果。尽管自推广上市以来,人重组骨形成蛋白-2(rhBMP-2)无论在实验或是临床应用中均显示了出色的效果,但其在实际应用当中依然存在一定的局限性。由于rhBMP-2是一种水溶性蛋白,如果直接采用缓释溶液为载体植入体内,其在体内清除速度非常快,仅有5%的蛋白会留在植入部位;纯化的rhBMP-2半衰期很短,植入体内数小时后即可被蛋白酶分解。出于以上原因考虑为获得良好的融合效果,目前临床上BMP-2的使用剂量均采用了毫克级的超生理浓度范围。而rhBMP-2的商品价格又非常昂贵,每年临床上可消耗上亿美元的医疗成本。此外,这种大剂量蛋白的治疗方法,往往会导致各种并发症包括软组织水肿,皮肤红疹、局部炎症反应、异位骨化和免疫反应,部分病例如颈前路手术患者,因其手术部位特殊,术后并发症可能造成较严重的后果,影响手术效果甚至导致瘫痪,直接影响患者的健康和生命安全。因此寻找一种最佳的生物材料作为BMP-2的载体已成为临床上的迫切需要。材料与方法:1.长效局部缓释型BMP-2纳米胶囊的制备、与可吸收胶原海绵固定以及形貌、性质测定首先以牛血清白蛋白作为模型蛋白进行试验,探索纳米胶囊制备的适合条件参数,再用所得条件制备BMP-2纳米胶囊。为使纳米胶囊表面携带大量氨基,提高化学反应效率,需要增强其正电性。同时,为提高纳米胶囊与海绵接触以及发生反应的几率,需要其保持较小的粒径。据此确定选取正电单体Spermine-V,中性单体/正电单体比例为1:1,与单体之间摩尔比例(P:M)为1:1000。采用一步原位聚合方法制备纳米胶囊。先制备得出多肽交联剂二(2-甲基-2-丙烯酸)2-羟基-1,3-丙二醇酯(GDMA),再按比例向BMP-2溶液中加入混合单体溶液丙烯酰胺(AAm)和精胺(Spermine-V)以及GDMA,在催化剂作用下密封反应器,室温反应后透析获得BMP-2纳米胶囊nBMP-2。再将小块可吸收胶原海绵(ACS)浸渍于nBMP-2、磷酸钠、EDC、NHS的混合溶液中发生聚合反应,使nBMP-2固定于ACS上。使用动态光散射仪(DLS)检测纳米胶囊粒径分布,平均颗粒大小,以及带电强弱。采用基质辅助激光解析电离质谱测试模拟固化反应前后蛋白溶液中分子质量的变化,确定固化反应的发生。再通过荧光显微镜观察分别采用纯蛋白BMP-2溶液,nBMP-2溶液以及与胶原蛋白化学共价键固定后的nBMP-2等3种不同溶液浸润胶原海绵,蛋白在海绵溶胀过程中的流失差异,测试BMP-2纳米胶囊的固定化效果。使用pH=10的磷酸盐溶液对GDMA作为交联剂制备得到的纳米胶囊样品进行处理,并使用DLS监测纳米胶囊粒径,根据纳米胶囊粒径随时间的变化情况,判断其有无发生明显降解,验证碱性PH值对BMP-2纳米胶囊的作用效果。2.长效局部缓释型BMP-2纳米胶囊缓释效果以及骨诱导能力的体外实验研究将ACS裁成小块放入Eppendorf管中。制备nBMP-2并将纳米胶囊固定在ACS表面,加入碱性缓冲液将溶液配制稀释成不同浓度的nBMP-2。向对照组管中分别加入对应浓度的BMP-2蛋白溶液,纳米单体分子Spermine V溶液及碱性缓冲液,调整PH值为碱性。将上述样品同时放入37°C细胞孵育箱内,分别于不同时间点采取样品。将每次取出的样品放置于-80℃冰箱冷冻保存,待检测使用。采用ELISA试剂盒对各组在各时间点采取的样品溶液中的BMP-2蛋白含量进行定量检测,验证纳米胶囊对BMP-2蛋白的缓释作用。按不同条件要求分别培养BMSCs, C3H10T1/2与MC3T3-E1三种细胞并种植于24孔组织培养板中。将保存的蛋白样品解冻后,向培养板中各孔内分别加入10μl蛋白样品,再将培养板放入37℃细胞孵育箱中培养96h,后分别采用碱性磷酸酶染色检测试剂盒与碱性磷酸酶荧光检测试剂盒对蛋白样品溶液作用于细胞96h后细胞的碱性磷酸酶活性进行半定量与定量检测,验证对比不同蛋白样品的骨诱导能力。3.长效局部缓释型BMP-2纳米胶囊促进大鼠脊柱融合的动物实验研究将30只大鼠随机分为3组,每组10只,按照术中植入蛋白不同分为:Group 1: nBMP-2溶液+可吸收胶原海绵(nBMP-2+ACS);Group 2: BMP-2溶液+可吸收胶原海绵(BMP-2+ACS);Group 3: PBS缓冲液+可吸收胶原海绵(PBS+ACS)。将大鼠麻醉后,以腰4/5为中心做背侧正中切口,神经剥离子沿棘突两侧向深部逐层剥离至双侧关节突关节,暴露双侧L4及L5横突。确认定位无误后,磨钻打磨L4横突下缘和L5横突上缘至显露松质骨且有骨面渗血。生理盐水冲洗创口,彻底止血,将滴加好蛋白样品的可吸收胶原海绵展平后纵行放置于L4、L5横突间。随访至术后第8周时,使用CO2窒息法将大鼠处死,切取大鼠腰椎标本。先对标本融合情况进行手法判断;再使用Faxitron小型橱柜式X光机(Faxitron Cabinet X-ray System)对大鼠标本进行X线检查,观察手术节段腰椎融合情况;使用SCANCO实验室微型CT系统给予CT扫描,观察手术节段腰椎融合情况并利用SCANCO软件测量选取节段的骨容积,对比nBMP-2与BMP-2诱导大鼠脊柱融合的能力。结果1.利用DLS测定得到的纳米胶囊粒径以及粒径分布结果显示,BMP-2蛋白平均粒径为3.5 nm,当发生原位聚合反应后,获得纳米胶囊粒径多集中在9 nm至12 nm之间,平均粒径为11nm,推断为单分子或双分子胶囊,高分子层外壳厚度在1 nm到3 nm左右。纳米胶囊表面携带+8.6 mV正电荷,颗粒表面存在大量氨基,与胶原海绵表面羧基较易发生反应。向可溶性BSA蛋白中加入EDC与NHS启动固定反应后,蛋白质之间发生反应,由于粒径增加而产生沉淀,证明固定反应的可行性。使用基质辅助激光解析电离质谱测试物质质量,在反应发生前溶液中测得为单分子BSA摩尔质量;而反应之后,质量峰数增加,且出现多个大分子的峰,确定有大分子物质生成,反应可以发生。显微镜下,胶原海绵溶胀前,三个样品的荧光强度均较强,随着溶胀时间增长,三个样品的荧光强度均有一定的减弱。其中纯蛋白BMP-2荧光强度减弱最快,1小时后荧光即大部分消失;nBMP-2蛋白荧光强度维持略优于BMP-2,11小时后仍保留了一定的荧光强度;与胶原蛋白结合后的nBMP-2荧光强度维持时间最长,11小时后仍有较强的荧光强度。由此可见胶原海绵与nBMP-2纳米胶囊发生的共价化学反应,能够有效的将BMP-2蛋白固定在胶原海绵上。使用DLS监测到的纳米胶囊粒径显示,当纳米颗粒在碱性环境中放置3小时以上时,其发生明显降解现象,至6小时后,其粒径约为4 nm,说明其高分子外壳已经完成降解,BMP-2蛋白分子完全放出,证明BMP-2纳米胶囊对碱性PH值反应敏感。2. ELISA结果显示BMP-2蛋白溶液中的蛋白的初始浓度(0 point)较高,为433.9 pg/ml,此后蛋白浓度迅速下降,至12小时下降至148.9 pg/ml,3天后低于50 pg/ml。而nBMP-2溶液中BMP-2蛋白初始浓度低于BMP-2溶液,为144.4 pg/ml,此后BMP-2蛋白浓度一直波动在200 pg/ml左右,至14天后略降至156.7 pg/ml,21天后仍保持在89.9 pg/ml。采用碱性磷酸酶染色检测试剂盒测试不同蛋白样品作用于细胞96小时后碱性磷酸酶活性的测定结果显示,各组细胞加入初始制备好的蛋白样品后(0 point),BMP-2溶液样品处理的细胞碱性磷酸酶活性均明显高于nBMP-2组;而加入制备完成12h所取样品后,各细胞中nBMP-2组的碱性磷酸酶活性开始略高于BMP-2组;加入3天时采取的样本后,nBMP-2组作用于细胞显示的碱性磷酸酶活性明显高于BMP-2组,并一直持续至观察终点21天。碱性磷酸酶活性定量结果与染色检测结果一致,三种细胞测得结果均显示12小时所采取nBMP-2溶液样品作用后的细胞碱性磷酸酶活性超过了对应同时间采集BMP-2溶液样品。纳米单体分子Monomer组和碱性缓冲液Basic Buffer组处理后的细胞碱性磷酸酶活性一直处于较低水平,二者无明显差异(P>0.05)。3.各组大鼠各时间点所得X线图像显示,术后8周BMP-2组中3例获得双侧融合,4例获得单侧融合,3例术后出现不融合;nBMP-2组术后所有大鼠手术节段横突间均获得双侧融合;PBS Buffer组中除2例有单侧融合表现外,其余各大鼠均未见明显新骨形成。nBMP-2组术后双侧融合率显著高于BMP-2组和PBS Buffer组。各组大鼠术后腰椎标本经手法判断的融合率分别为:BMP-2组40%,nBMP-2组100%,PBS Buffer组0。nBMP-2组融合率显著高于另外两组(P<0.001)。CT测得各组术后融合率与X线检查结果一致,BMP-2组术后扫描节段平均骨容积为221.0±22.8 mm~3,显著高于PBS Buffer组(P=0.001),nBMP-2组术后扫描节段骨容积为269.2±18.0 mm~3,显著高于PBS Buffer组(P<0.001)和native-BMP-2组(P<0.001)。结论我们采用正电单体Spermine-V和多肽交联剂GDMA制备得到了包裹在BMP-2蛋白表面纳米级大小的新型纳米胶囊nBMP-2,并利用聚合反应,成功的将nBMP-2固定于可吸收胶原海绵上。多项体外及体内动物实验检测证实采用这种方法,BMP-2纳米胶囊以化学共价键形式固定于胶原海绵上,大大减少了蛋白在体液环境中的流失;采用碱性环境作为纳米胶囊释放的驱动条件,可实现蛋白的持续、可控性缓慢释放,有利于维持植入部位较高浓度BMP-2蛋白持续存在,提高骨融合率。此外,从理论上讲,在蛋白释放前,BMP-2表面由于被单体分子外壳所覆盖,活性基团被保护在胶囊内部,蛋白的活性可得到完全保存;同时各种抗原基团包裹在胶囊内部,也能够避免植入蛋白所带来的炎症反应以及免疫反应。因而这种纳米胶囊与可吸收胶原海绵组成的BMP-2蛋白载体,具有良好的生物相容性、生物可降解性、低抗原及免疫原性,能够维持并提高BMP的生物活性,实现蛋白的可控释放,制备简单,安全、稳定、可消毒、经济实用,是BMP-2的一种理想载体。但对于纳米胶囊能够降低BMP-2所致炎症反应和免疫反应的作用,还需进一步体内及体外实验加以验证。