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急性缺血性脑卒中发病率逐年增高,且有年轻化趋势,已成为我国成年人群致死/残的首位病因,其标准治疗方法是时间窗内血管内机械取栓或静脉溶栓通过疏通堵塞血管,恢复血液灌注,以挽救缺血半暗带区脑组织,从而改善脑卒中患者的临床症状及预后。然而,血液再灌注可能会继发炎症、氧化应激、钙超载等进一步加重脑组织损伤,即脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）。凋亡在脑缺血再灌注损伤的发生发展过程中发挥重要作用,决定着脑梗死体积的大小及患者临床症状的轻重。抑制细胞凋亡可改善脑卒中患者的转归和预后。钙敏感受体（calcium sensing receptor,CaSR）是G蛋白耦联受体超家族C家族成员之一,在中枢神经系统神经元细胞上表达,可被细胞外钙离子激活,通过诱导细胞凋亡参与缺血再灌注损伤。常用于缺血性脑血管病治疗的中药黄芪的主要活性成分黄芪甲苷,具有清除自由基、抗炎、抗凋亡、调节能量代谢等作用,可通过抑制细胞凋亡来缓解CIRI。然而,黄芪甲苷抗CIRI的作用是否与CaSR有关尚不清楚。因此,本研究以CaSR为切入点,分别建立SD大鼠大脑中动脉堵塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型和PC12细胞氧糖剥夺/复氧复糖（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）模型模拟CIRI的发生发展过程,并通过黄芪甲苷、CaSR抑制剂和CaSR激活剂干预CIRI,研究黄芪甲苷减轻CIRI的神经保护作用是否与CaSR有关,并探讨其具体作用机制。第一部分钙敏感受体参与黄芪甲苷减轻脑缺血再灌注损伤的研究目的:通过建立在体和离体CIRI模型,观察黄芪甲苷和CaSR抑制剂NPS-2143对CIRI的保护作用。方法:以改良线栓法建立大鼠MCAO/R模型模拟CIRI,并建立PC12细胞OGD/R模型模拟脑缺血再灌注对神经细胞的损伤。在体实验:清洁级、健康、雄性SD大鼠,随机分为:假手术组（Sham）、模型组（MCAO/R）、黄芪甲苷组（AST-IV）和CaSR抑制剂组（NPS-2143）。除假手术组外,其他各组均缺血2 h、再灌注24 h。AST-IV组和NPS-2143组于再灌注的同时分别腹腔注射黄芪甲苷20 mg·Kg-1和NPS-2143 10μmol·Kg-1。根据Zea Longa评分结果选取造模成功的大鼠进行实验研究。采用TTC染色观察脑梗死体积,H&E染色观察缺血侧脑组织神经细胞形态和数量,尼氏染色法观察黄芪甲苷和NPS-2143对MCAO/R大鼠尼氏体数量影响,Western blot检测脑组织CaSR表达水平。离体实验:对数生长期PC12细胞随机分为正常对照组（Control）、模型组（OGD/R）、黄芪甲苷组（AST-IV）和CaSR抑制剂组（NPS-2143）。除Control组外,其余各组均氧糖剥夺2 h、复氧复糖24 h造模处理。AST-IV组于复氧复糖的同时给予不同浓度黄芪甲苷（50,100,150,200μmol/L）以CCK-8法检测细胞存活率选定最佳黄芪甲苷浓度。NPS-2143组于复氧复糖的同时给予NPS-2143 25μmol/L。采用倒置显微镜观察细胞生长状态和CCK-8法检测黄芪甲苷和NPS-2143对OGD/R模型PC12细胞存活率的影响,Western blot检测PC12细胞CaSR表达水平。结果:1.在体实验:（1）神经功能缺损情况:Zea Longa神经功能学评分结果显示:与Sham组相比,MCAO/R组大鼠神经功能评分明显增高（P<0.05）;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组大鼠神经功能评分明显降低（P<0.05）。（2）脑梗死体积TTC染色结果显示:与Sham组相比,MCAO/R组大鼠左侧脑组织出现大范围梗死灶（P<0.05）;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组大鼠脑梗死体积明显缩小（P<0.05）。（3）脑组织病理形态改变:（1）H&E染色结果:Sham组大鼠脑组织形态结构无明显改变;MCAO/R组大鼠缺血侧脑组织出现神经元凋亡和坏死,神经细胞大量丢失,与Sham组相比有明显差异（P<0.05）;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组大鼠脑组织病理形态改变明显减轻,神经细胞损伤减轻、丢失减少（P<0.05）。（2）尼氏染色结果:Sham组大鼠神经细胞正常,尼氏体丰富;MCAO/R组大鼠缺血侧脑组织神经细胞损伤严重、尼氏体着色变浅,数量减少（P<0.05）;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组大鼠脑组织神经细胞形态改变减轻,尼氏体增多（P<0.05）。（4）脑组织CaSR蛋白表达情况:Western blot检测结果显示:与Sham组相比,MCAO/R组大鼠脑组织CaSR蛋白表达增多（P<0.05）;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组大鼠脑组织CaSR蛋白表达减少（P<0.05）。2.离体实验:（1）PC12细胞存活率:CCK-8检测结果显示:与Control组相比,OGD/R组PC12细胞存活率明显降低（P<0.05）;与OGD/R组相比,不同浓度黄芪甲苷均能明显提高OGD/R模型PC12细胞存活率（P<0.05）,其中以100μmol/L浓度黄芪甲苷对OGD/R模型PC12细胞的保护作用最明显。故选取100μmol/L浓度黄芪甲苷用于后续实验研究。NPS-2143亦可明显提高PC12细胞存活率（P<0.05）。（2）PC12细胞形态:Control组PC12细胞贴壁生长、细胞形态正常、折光性强;与Control组相比,OGD/R组PC12细胞贴壁较差、胞体肿胀、变圆、突起消失、折光性较差;与OGD/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组PC12细胞生长状态好转。（3）PC12细胞CaSR蛋白表达情况:Western blot检测结果显示:与Control组相比,OGD/R组PC12细胞CaSR蛋白表达增多（P<0.05）;与OGD/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组PC12细胞CaSR蛋白表达减少（P<0.05）。小结:1.黄芪甲苷和CaSR抑制剂NPS-2143均可显著降低MCAO/R模型大鼠神经功能评分,缩小大鼠脑梗死体积,减少神经细胞和尼氏体的丢失,减轻脑组织神经细胞损伤,发挥对CIRI的神经保护作用。2.黄芪甲苷可显著提高OGD/R模型PC12细胞存活率,改善细胞生长状态,以100μmol/L浓度黄芪甲苷为最佳实验浓度;CaSR抑制剂NPS-2143与黄芪甲苷有相似作用。3.黄芪甲苷可能通过抑制CaSR的表达发挥对CIRI的神经保护作用。第二部分钙敏感受体参与黄芪甲苷减轻脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的研究目的:观察黄芪甲苷和CaSR抑制剂NPS-2143对CIRI后细胞凋亡的影响,初步探讨黄芪甲苷减轻CIRI诱导的细胞凋亡的作用机制。方法:建立SD大鼠MCAO/R模型和PC12细胞OGD/R模型,模拟CIRI过程。造模及分组方法同第一部分。在体实验采用透射电子显微镜观察脑组织神经细胞超微结构,免疫荧光检测CaSR蛋白表达情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Bcl-2和Bax表达水平。离体实验通过流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测Caspase 3、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。观察黄芪甲苷和NPS-2143减轻CIRI诱导的细胞凋亡的作用。结果:1.在体实验:（1）脑组织神经细胞超微结构改变:透射电子显微镜观察结果显示:Sham组大鼠脑组织神经细胞结构正常;MCAO/R组大鼠脑组织神经细胞核不规则,核内异染色质增多、边集到核膜内侧,甚至核膜断裂、溶解;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组大鼠脑组织神经细胞超微结构改变明显减轻。（2）CaSR蛋白在神经元细胞上的表达情况:免疫荧光双标染色结果显示:Sham组大鼠脑组织神经元数量较多,CaSR表达较少;与Sham组相比,MCAO/R组大鼠脑组织神经元细胞上CaSR蛋白表达增多;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组大鼠脑组织神经元细胞上CaSR蛋白表达减少。（3）Caspase 3、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平:Western blot检测结果显示:与Sham组相比,MCAO/R组大鼠脑组织Caspase 3蛋白表达上调（P<0.05）,Bcl-2/Bax减小（P<0.05）;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组大鼠脑组织Caspase 3蛋白表达下调（P<0.05）,Bcl-2/Bax增大（P<0.05）。2.离体实验:（1）细胞凋亡率:流式细胞术检测结果显示:与Control组相比,OGD/R组PC12细胞凋亡率明显升高（P<0.05）;与OGD/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组PC12细胞凋亡率明显降低（P<0.05）。（2）Caspase 3、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平:Western blot检测结果显示:与Control组相比,OGD/R组PC12细胞Caspase 3蛋白表达上调（P<0.05）,Bcl-2/Bax减小（P<0.05）;与OGD/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组PC12细胞Caspase 3蛋白表达下调（P<0.05）,Bcl-2/Bax增大（P<0.05）。小结:1.黄芪甲苷和CaSR抑制剂NPS-2143均可明显下调MCAO/R诱导的大鼠脑组织神经细胞CaSR表达水平,降低Caspase 3蛋白表达,升高Bcl-2/Bax,减轻MCAO/R诱导的大鼠脑组织细胞凋亡。2.黄芪甲苷和CaSR抑制剂NPS-2143均可明显减轻OGD/R诱导的PC12细胞凋亡率,下调Caspase 3蛋白表达,增大Bcl-2/Bax,减轻OGD/R诱导的PC12细胞凋亡。3.黄芪甲苷可能通过抑制CaSR的表达减轻CIRI诱导的细胞凋亡。第三部分黄芪甲苷通过抑制钙敏感受体表达减轻脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的机制研究目的:探讨黄芪甲苷抑制钙敏感受体减轻脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的机制。方法:（1）建立SD大鼠MCAO/R模型模拟CIRI过程。大鼠随机分为:假手术组（Sham）、模型组（MCAO/R）、黄芪甲苷组（AST-IV）、CaSR激活剂组（GdCl3）、黄芪甲苷+CaSR激活剂组（AST-IV+GdCl3）和CaSR抑制剂组（NPS-2143）。AST-IV组、GdCl3组、AST-IV+GdCl3组和NPS-2143组于再灌注的同时分别腹腔注射黄芪甲苷20 mg·Kg-1,GdCl3 30μmol·Kg-1,黄芪甲苷20 mg·Kg-1+GdCl3 30μmol·Kg-1,和NPS-2143 10μmol·Kg-1。采用TUNEL染色法观察细胞凋亡情况,微板法检测血清及脑组织内钙离子浓度;透射电子显微镜观察线粒体损伤情况;Western blot法检测凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor,AIF）蛋白表达变化。（2）建立PC12细胞OGD/R模型,模拟脑缺血再灌注对神经细胞的损伤。PC12细胞随机分为正常对照组（Control）、模型组（OGD/R）、黄芪甲苷组（AST-IV）、CaSR激活剂组（GdCl3）、黄芪甲苷+CaSR激活剂组（AST-IV+GdCl3）和CaSR抑制剂组（NPS-2143）。AST-IV组、GdCl3组、AST-IV+GdCl3组和NPS-2143组分别于复氧复糖的同时给予含黄芪甲苷（100μmol/L）、GdCl3（150μmol/L）、黄芪甲苷（100μmol/L）+GdCl3（150μmol/L）以及NPS-2143（25μmol/L）的细胞培养液。采用流式细胞术检测细胞凋亡率;微板法检测细胞培养液及细胞内钙离子浓度;JC-1染色法测定线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）;Western blot法检测AIF蛋白表达变化。结果:1.在体实验:（1）脑组织神经细胞凋亡情况:TUNEL染色结果:与Sham组相比,MCAO/R组大鼠缺血侧脑组织皮质区细胞凋亡指数明显增大（P<0.05）;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组细胞凋亡指数明显减小（P<0.05）,GdCl3组细胞凋亡指数明显增大（P<0.05）;与AST-IV组相比,GdCl3组和AST-IV+GdCl3组细胞凋亡指数明显增大（P<0.05）;与GdCl3组相比,AST-IV+GdCl3组和NPS-2143组细胞凋亡指数明显减小（P<0.05）。（2）血清钙离子水平:各组大鼠血清钙离子含量无明显差异（P>0.05）。（3）脑组织钙离子水平:与Sham组相比,MCAO/R组大鼠脑组织钙离子含量明显升高（P<0.05）;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组大鼠脑组织钙离子含量明显降低（P<0.05）,GdCl3组钙离子含量明显增高（P<0.05）;与AST-IV组相比,GdCl3组和AST-IV+GdCl3组钙离子含量明显增高（P<0.05）;与GdCl3组相比,AST-IV+GdCl3组和NPS-2143组钙离子含量明显降低（P<0.05）。（4）脑组织神经细胞线粒体结构:透射电子显微镜观察结果显示:Sham组大鼠脑组织缺血侧皮质区神经细胞线粒体结构正常,呈圆形或杆状,线粒体膜完整、嵴发达;MCAO/R组可见线粒体肿胀,呈球形,线粒体膜不完整、嵴断裂甚至消失;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组线粒体结构有所改善,而GdCl3组线粒体损伤更加严重;与AST-IV组相比,GdCl3组和AST-IV+GdCl3组线粒体损伤更加严重;与GdCl3组相比,AST-IV+GdCl3组和NPS-2143组线粒体结构损伤较轻。（5）AIF蛋白表达水平:Western blot检测结果显示:与Sham组相比,MCAO/R组缺血区脑组织AIF蛋白表达上调（P<0.05）;与MCAO/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组AIF蛋白表达下调（P<0.05）,GdCl3组AIF蛋白表达上调（P<0.05）;与AST-IV组相比,GdCl3组和AST-IV+GdCl3组细胞AIF蛋白表达上调（P<0.05）;与GdCl3组相比,AST-IV+GdCl3组和NPS-2143组细胞AIF蛋白表达下调（P<0.05）。2.离体实验:（1）细胞凋亡率:流式细胞术检测结果显示:与Control组相比,OGD/R组PC12细胞凋亡率明显增高（P<0.05）;与OGD/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组细胞凋亡率明显下降（P<0.05）,GdCl3组细胞凋亡率明显升高（P<0.05）;与AST-IV组相比,GdCl3组和AST-IV+GdCl3组细胞凋亡率明显增高（P<0.05）;与GdCl3组相比,AST-IV+GdCl3组细胞凋亡率明显降低（P<0.05）。（2）细胞培养液上清中钙离子水平:与Control组相比,OGD/R组PC12细胞培养液上清中钙离子浓度明显下降（P<0.05）;与OGD/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组钙离子浓度明显增高（P<0.05）,GdCl3钙离子浓度明显降低（P<0.05）;与AST-IV组相比,AST+GdCl3组和GdCl3组钙离子浓度明显降低（P<0.05）;与GdCl3组相比AST-IV+GdCl3组和NPS-2143组钙离子浓度明显升高（P<0.05）。（3）细胞内钙离子水平:与Control组相比,OGD/R组PC12细胞内钙离子浓度明显增高（P<0.05）;与OGD/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组细胞内钙离子浓度明显下降（P<0.05）,GdCl3组细胞内钙离子浓度明显升高（P<0.05）;与AST-IV组相比,GdCl3组和AST-IV+GdCl3组细胞内钙离子浓度明显升高（P<0.05）;与GdCl3组相比AST-IV+GdCl3组和NPS-2143组细胞内钙离子浓度明显降低（P<0.05）。（4）线粒体膜电位:与Control组相比,OGD/R组PC12细胞MMP明显降低（P<0.05）;与OGD/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组细胞MMP明显升高（P<0.05）,GdCl3组细胞MMP明显降低（P<0.05）;与AST-IV组相比,GdCl3组和AST-IV+GdCl3组细胞MMP明显降低（P<0.05）;与GdCl3组相比,AST-IV+GdCl3组和NPS-2143组细胞MMP明显升高（P<0.05）。（5）AIF蛋白表达水平:Western blot检测结果显示:与Control组相比,OGD/R组PC12细胞AIF蛋白表达上调（P<0.05）;与OGD/R组相比,AST-IV组和NPS-2143组AIF蛋白表达下调（P<0.05）,GdCl3组AIF蛋白表达上调（P<0.05）;与AST-IV组相比,GdCl3组和AST-IV+GdCl3组细胞AIF蛋白表达上调（P<0.05）;与GdCl3组相比,AST-IV+GdCl3组和NPS-2143组细胞AIF蛋白表达下调（P<0.05）。小结:1.黄芪甲苷可抑制MCAO/R诱导的大鼠脑组织缺血区脑组织内钙离子浓度升高,减轻线粒体结构损伤,下调AIF的表达水平,从而抑制MCAO/R诱导的细胞凋亡。CaSR激动剂GdCl3可部分抵消黄芪甲苷对CIRI的保护作用。2.黄芪甲苷可抑制OGD/R诱导的PC12细胞外钙离子内流,抑制细胞内钙超载,抑制MMP的下降,下调AIF的表达水平,从而抑制OGD/R诱导的PC12细胞凋亡。CaSR激动剂GdCl3可部分抵消黄芪甲苷对CIRI的保护作用。结论:1.黄芪甲苷可降低MCAO/R大鼠神经功能评分,减少大鼠脑梗死体积,减少神经细胞和尼氏体的丢失,减轻脑组织损伤;并可提高OGD/R模型PC12细胞存活率,改善细胞生长状态。钙敏感受体参与了以上作用。2.黄芪甲苷能够降低MCAO/R诱导的大鼠脑组织CaSR表达水平,抑制Caspase 3蛋白表达、升高Bcl-2/Bax、减轻MCAO/R诱导的大鼠脑组织细胞凋亡;并可明显减轻OGD/R诱导的PC12细胞凋亡率,下调CaSR、Caspase 3蛋白表达,增大Bcl-2/Bax,减轻OGD/R诱导的PC12细胞凋亡。钙敏感受体参与了黄芪甲苷对细胞凋亡的抑制作用。3.黄芪甲苷可通过抑制MCAO/R诱导的大鼠脑组织CaSR蛋白的表达,抑制缺血区脑组织内钙离子浓度升高,减轻线粒体结构损伤,下调AIF的表达水平,从而抑制MCAO/R诱导的细胞凋亡。并且,黄芪甲苷可通过抑制OGD/R诱导的PC12细胞CaSR蛋白的表达,抑制细胞外钙离子内流,减轻细胞内钙超载,抑制MMP的下降,下调AIF的表达水平,从而抑制OGD/R诱导的PC12细胞凋亡。综上,黄芪甲苷可通过抑制钙敏感受体表达,减轻脑缺血再灌注后细胞内钙超载,从而抑制细胞凋亡,缓解CIRI。