研究背景:在正常的生长发育过程中,成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收互相耦联,在多种细胞、细胞因子和刺激物质的共同参与和精密调控下,使骨组织处于动态平衡的状态,维持着骨骼正常结构和生理功能的稳定。破骨细胞是由骨髓中的单核/巨噬细胞谱系融合分化而成,对于骨骼稳态的维持发挥重要作用,它是迄今为止发现的唯一具有骨吸收功能的细胞,不仅参与生理性骨重塑,在病理性骨代谢中同样发挥着重要的作用。有研究表明在诸如骨质疏松、肿瘤骨转移和风湿性关节炎等与骨代谢相关的疾病中,破骨细胞的分化及其所致骨吸收过度增强,对这些疾病的进展和预后产生重要影响。骨髓在正常生理情况下即处于氧体积分数约6.6%的低氧微环境中,骨折、炎症和肿瘤等诸多病理情况会导致骨内血流或供氧减少,进而使骨微环境处于更为明显的病理性低氧状态。许多研究针对缺氧和缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）如何影响破骨细胞的分化和活性进行了探索,但目前还没有明确具体的分子机制,在不同的研究中得出了不同的结论。目的:研究低氧/HIF-1α通路在RAW264.7细胞向成熟破骨细胞分化过程中的调控作用,并初步探讨其可能的分子机制。方法:1.应用实时荧光定量PCR和TRAP染色检测CoCl₂诱导的缺氧对RAW264.7细胞向成熟破骨细胞分化的影响。2.应用实时荧光定量PCR和Western blot分别从mRNA及蛋白水平检测CoCl₂诱导的缺氧对RAW264.7细胞分化过程中HIF-1α表达的影响。3.使用HIF-1α-shRNA沉默RAW264.7细胞内HIF-1α的表达,通过实时荧光定量PCR和TRAP染色检测RAW264.7细胞的分化情况,明确HIF-1α是否介导了CoCl₂诱导的缺氧对破骨细胞分化的调控。4.应用实时荧光定量PCR和Western blot分别从mRNA及蛋白水平检测CoCl₂诱导的缺氧对RAW264.7细胞分化过程中NRP-1表达的影响。5.应用Western blot检测沉默HIF-1α后对NRP-1表达的影响,明确HIF-1α是否介导了CoCl₂诱导的缺氧对NRP-1的调控。6.使用NRP-1-shRNA沉默RAW264.7细胞内NRP-1的表达,通过实时荧光定量PCR和TRAP染色检测RAW264.7细胞的分化情况,明确NRP-1是否介导了CoCl₂诱导的缺氧对破骨细胞分化的调控。结果:1.CoCl₂诱导的缺氧明显降低了破骨细胞分化相关基因Cath K、MMP-9、TRAP mRNA的表达（P<0.05）,减少了TRAP染色阳性破骨细胞的数量（P<0.05）。2.CoCl₂诱导的缺氧可显著上调RAW264.7细胞分化过程中HIF-1α蛋白的表达量（P<0.05）,而对HIF-1αmRNA的表达水平未产生影响。3.在CoCl₂诱导的缺氧条件下,沉默RAW264.7细胞中HIF-1α的表达可以上调破骨细胞分化相关基因Cath K、MMP-9、TRAP mRNA的表达水平（P<0.05）,增加TRAP染色阳性破骨细胞的数量（P<0.05）。4.CoCl₂诱导的缺氧可显著上调RAW264.7细胞分化过程中NRP-1蛋白和mRNA水平的表达（P<0.05）。5.在CoCl₂诱导的缺氧条件下,沉默RAW264.7细胞中HIF-1α表达可以显著抑制NRP-1蛋白的表达（P<0.05）。6.在CoCl₂诱导的缺氧条件下,沉默RAW264.7细胞中NRP-1的表达可以上调破骨细胞分化相关基因Cath K、MMP-9、TRAP mRNA的表达水平（P<0.05）,增加TRAP染色阳性破骨细胞的数量（P<0.05）。结论:CoCl₂诱导的缺氧可能通过HIF-1α介导NRP-1上调来抑制RAW264.7细胞向成熟破骨细胞分化。