紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上分布和种植面积最广的一种多年生豆科牧草,其品质优良、营养成分丰富、适口性极佳,被誉为“牧草之王”。但是,反刍家畜鲜食过量苜蓿后容易引发臌胀病,严重时会导致家畜死亡,因而限制了这种优良牧草在畜牧业生产中的应用。研究发现,紫花苜蓿中缩合单宁(condensed tannins,CT)含量较低是引发反刍家畜臌胀病的主要因素之一。因此,适当提高紫花苜蓿中缩合单宁的含量,可以降低反刍家畜臌胀病发生几率,具有重要的理论和实践意义。本试验通过农杆菌介导法将编码缩合单宁合成途径中的关键酶(花青素还原酶)基因,即BAN基因转入紫花苜蓿栽培品种‘甘农3号’紫花苜蓿基因组中,并对T0代转化植株花青素还原酶(ANR)活性和缩合单宁含量进行了测定,为抗臌胀病转基因苜蓿新品种的育成奠定了基础。具体研究内容及结果如下:1.高效再生体系的优化。以‘甘农3号’紫花苜蓿下胚轴为外植体,进行了愈伤组织诱导、芽分化及生根的研究。结果表明:苜蓿愈伤组织诱导以3.0 mg/L 2,4-D和1.0 mg/L NAA配比处理为最佳,愈伤组织诱导率达84.67%;愈伤组织分化则以0.5 mg/L KT和0.5mg/L NAA配比处理为最佳,体胚诱导率最高,达92.00%,后期胚状体出芽率也最高,达81.52%;芽生根时以1/2 MS培养基为基础单独添加0.5 mg/L NAA处理为最佳,诱根率达86.00%,且根系长、粗壮、须根发达,有利于后期移栽。2.遗传转化体系的建立。以‘甘农3号’紫花苜蓿下胚轴为外植体,以含有CPB-BAN-GFP载体的农杆菌为介导,优化遗传转化体系。结果表明:最适草铵膦筛选浓度为2.0 mg/L,最佳筛选时间为愈伤组织分化阶段;脱菌时抗生素选取浓度为300 mg/L头孢霉素(Cef)为宜;农杆菌侵染时间为15 min,菌液浓度OD600为0.6~0.8,共培养时间为3 d时有利于基因转化。3.转基因苜蓿的分子检测及表达分析。以上述遗传转化和再生体系为基础,通过初步筛选共获得8株抗草铵膦苜蓿植株。经PCR检测,4株抗性植株扩增出了大小为1020 bp的特异性条带,并通过Southern blot检测证实BAN基因已经整合到这4株阳性植株的基因组中。进一步通过RT-PCR和qRT-PCR检测,结果显示外源BAN基因可在转基因植株的转录水平上正常表达。4.转基因苜蓿ANR活性和缩合单宁含量的测定。通过对已鉴定的4株转基因苜蓿ANR活性和缩合单宁含量分析表明:与野生型植株相比,4株转基因苜蓿ANR活性均显著提高,而其中1株缩合单宁含量得到大幅度提高,并且可能因ANR酶活性的上升促进了花青素的合成,导致该植株部分叶片呈现紫红色,BAN基因过量表达。