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前言细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)磷酸化苏氨酸/丝氨酸残基形成活化形式的ERK1/2(p-ERK1/2)。该磷酸化及其下游的信号传导通路在神经元发育过程中具有重要意义。在成熟脑内,ERK1/2的磷酸化与记忆形成和突触可塑性密切相关。早期研究表明,将培养的神经元、PC12细胞以及脑片暴露在高钾、谷氨酸或谷氨酸受体激动剂条件下,可引起p-ERK1/2水平升高。上皮生长因子受体（EGFR）间接激活是一种由外界刺激或G蛋白耦联受体（GPCR）激活,导致某种生长因子的释放,进而激活自身和相邻的酪氨酸激酶受体,产生与直接激活酪氨酸激酶（RTK）相似效应的过程。它是近年来所发现一种新的信号传导途径。EGFR间接激活对于调节神经元本身功能及其周围细胞的功能具有重要作用。在EGFR间接激活过程中,G蛋白耦联受体的激活和去极化引起的细胞内游离钙离子浓度升高,均可导致金属蛋白酶催化的EGFR配体的释放,进而活化自身以及相邻细胞的上皮生长因子受体。在EGFR配体家族中,转化生长因子-α（TGF-α）、肝素结合上皮生长因子（HB-EGF）在体内小脑颗粒神经元和小脑外颗粒层上表达。有关其它配体的表达,目前尚不明确。原代培养7-8天小脑颗粒神经元,谷氨酸能受体分化成熟,其中包括N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑受体（AMPAR）和代谢型谷氨酸受体（mGluR）。本篇文章主要研究高钾去极化引起原代培养小脑颗粒神经元ERK1/2磷酸化的机制。即（1）上皮生长因子受体间接激活是否参与高钾去极化引起的小脑颗粒神经元ERK1/2磷酸化。（2）高钾去极化引起小脑颗粒神经元ERK1/2磷酸化过程中,是否依赖于谷氨酸受体的激活。（3）EGFR相关配体在原代培养的小脑颗粒神经元上的表达。（4）PKC是否参与上皮生长因子受体间接激活信号传导途径。方法采用原代培养的小脑颗粒神经元。将细胞在3℃无血清相关培养液中孵育5-60分钟,含有5mM、10mM、25mM、45mM[K+]e或50μM谷氨酸以及相关特异性抑制剂。应用冰PBS洗涤细胞,加入裂解液,终止反应,收集细胞。进行凝胶电泳,免疫印迹分析。ERK1/2在本文中仅用做样品加样的监测指标,而在统计分析中未涉及ERK1/2。使用SPSS12.0软件进行统计学分析,多组资料用one-wayANOVA方法进行比较,P＜0.05表示差异具有统计学意义。结果1、高钾诱导ERK1/2磷酸化高钾在小脑颗粒神经元引起p-ERK1/2升高。在[K+]e浓度为10mM、25mM时,磷酸化水平略有升高,在25mM时,p-ERK1组升高具有统计学意义。在[K+]e浓度为45mM时,磷酸化水平明显升高,且具有统计学意义。[K+]e引起ERK1/2磷酸化的时间相对较晚,45mM[K+]e作用在10分钟后,p-ERK1/2开始升高,20分钟后升高具有统计学意义,在40分钟时下降,60分钟后再次升高具有统计学意义。2、上皮生长因子家族相关成员mRNA表达在原代培养8天的小脑颗粒神经元及成年小鼠小脑内,HB-EGF、TGF-α均有表达。但EGF（上皮生长因子）和Amphiregulin（双向调节蛋白）在神经元和小脑内均无表达。3、TRK、金属蛋白酶抑制剂和肝素的作用应用上皮生长因子受体抑制剂1μM AG1478可以抑制45mM[K+]e20分钟引起的ERK1/2磷酸化,差异具有统计学意义。而AG1478对45mM[K+]e60分钟引起ERK1/2磷酸化不完全抑制,差异具有统计学意义。10μM Zn2+依赖性金属蛋白酶抑制剂GM6001,能够阻断45mM[K+]e20分钟引起的ERK1/2磷酸化。1mg/ml肝素能够抑制此磷酸化反应,差异具有统计学意义。4、谷氨酸和其受体拮抗剂的作用应用50μM谷氨酸作用于神经元,可引起与去极化相似的ERK1/2磷酸化。50μM谷氨酸引起小脑颗粒神经元ERK1/2磷酸化,此反应可以被AG1478、GM6001所抑制。NMDA受体拮抗剂MK801（1μM）和非NMDA受体拮抗剂CNQX（10μM）也能够抑制谷氨酸引起的ERK1/2磷酸化。另外,NMDA受体拮抗剂MK801和非NMDA受体拮抗剂CNQX也可抑制45mM[K+]e在20分钟和60分钟引起的ERK1/2磷酸化。5、在不含谷氨酰胺的培养液中细胞外高钾的作用将神经元在不含谷氨酸前体-谷氨酰胺的盐溶液中孵育,细胞外的谷氨酸浓度明显降低,高钾诱导的谷氨酸释放也被抑制。将细胞暴露45mM[K+]e20分钟和60分钟可引起ERK1/2的磷酸化升高,但AG1478无抑制作用。表明在此条件下,高钾刺激的ERK1/2的磷酸化不依赖于EGFR间接激活。6、PKC抑制剂的影响将神经元在不含谷氨酰胺培养液中孵育,45mM[K+]e在20分钟时引起的ERK1/2的磷酸化,PKC抑制剂GF109203X不能抑制该磷酸化反应。在含有谷氨酰胺的培养液中,高钾引起的ERK1/2的磷酸化升高主要是由于去极化导致谷氨酸释放增加。此反应在20分钟时可被GF109203X抑制。但是对60分钟时同样条件下ERK1/2的磷酸化没有影响。在含有谷氨酰胺的培养液中,50μM的谷氨酸刺激5分钟后ERK1/2的磷酸化增加可被PKC的抑制剂不完全抑制。虽然50μM的谷氨酸条件下PKC抑制剂抑制作用轻微,但是明显超过了没有谷氨酸条件下PKC抑制剂的作用。讨论目前研究表明,上皮生长因子家族成员至少有7种:HB-EGF、TGF-α、EGF、Amphiregulin、BTC（β-细胞素）、EPR（表皮调节素）和epigen。仅前四种在脑内表达,其中HB-EGF、TGF-α存在于小脑及原代培养颗粒神经元。应用原位杂交技术检测在体内小脑颗粒神经元上有TGF-α的表达。HB-EGF在发育初期脑内表达水平达到高峰,并在脑内持续表达。EGF在前脑和皮层星形胶质细胞存在表达,而在原代培养的小脑颗粒神经元以及成年小脑内均无表达。上皮生长因子受体家族（ErbB家族）广泛存在于脑内,包括ErbB1（EGFR）、ErbB2、ErbB3和ErbB4,并且已证实在原代培养的小脑颗粒神经元上表达。该受体激活引起受体酪氨酸激酶磷酸化,进而激活有丝分裂活化蛋白激酶(包括ERK1/2)和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）。ErbB4对于神经元迁移和突触可塑性具有重要意义。小脑颗粒神经元中表达的神经体调节蛋白是一种ErbB4的激动剂,能够诱导放射胶质细胞形成和颗粒细胞的迁移。在原代培养小脑颗粒神经元中,EGF能够引起MAP激酶活化。基质金属蛋白酶MMP2、3、9在小脑内表达,可能参与间接激活过程。在对皮质扩散性抑制的研究中发现,伴随着大量K+和谷氨酸的释放,位于大脑皮层的MMP9发生活化。在神经元上皮生长因子受体间接激活的研究中,早期发现该途径存在于GT1-7细胞系（促性腺激素释放激素下丘脑神经元细胞系）中。另外,经去极化、缓激肽以及cAMP处理的PC12细胞（嗜铬细胞瘤细胞系）也存在上皮生长因子受体间接激活信号传导通路。然而,目前在原代培养的神经元中尚无EGFR间接激活报道。该信号传导途径所涉及的生长因子释放相当复杂,而且可能具有细胞特异性、G蛋白耦联受体特异性和发育生物学特异性。最近我们实验室发现,在原代培养星形胶质细胞中,α-肾上腺素能受体激动剂右旋美托咪啶通过G蛋白βγ亚基,蛋白激酶C、Scr激酶、金属蛋白酶以及TRK活化,从而引起ERK1/2的磷酸化。在原代培养的小脑颗粒神经元中,星形胶质细胞约占总含量的5-10%,主要表达代谢性谷氨酸受体,目前尚无NMDA受体在星形胶质细胞表达的报道。所以,星形胶质细胞上皮生长因子受体的激活不可能成为去极化引起小脑颗粒神经元ERK1/2的磷酸化的机制。本课题研究表明在原代培养的小脑颗粒神经元由高钾去极化诱导的ERK1/2的磷酸化是一个相当复杂的过程。高钾去极化条件下在20和60分钟引起谷氨酸释放进而引起ERK1/2磷酸化。仅在20分钟时ERK1/2磷酸化依赖于PKC活性。在相同条件下,50μM的谷氨酸5分钟引起的ERK1/2的磷酸化增加仅部分依赖于PKC活性,说明其对PKC抑制剂不敏感。但高钾去极化在20和60分钟时所诱发ERK1/2磷酸化并不完全依赖于EGFR的间接激活,并且20分钟时也不依赖于PKC的活化。在原代培养的小脑颗粒神经元中,NMDA受体抑制剂MK801和非NMDA受体抑制剂CNQX可以阻断高钾去极化及谷氨酸引起的ERK1/2磷酸化,提示该过程依赖于NMDA受体和非NMDA受体的激活,这与Baron等人在海马切片上发现一致,CNQX可以完全阻断KCI引起ERK1/2磷酸化,而NMDA受体拮抗剂AP5也部分抑制该反应。在对小脑颗粒神经元研究中,早期发现NMDA受体的激活可以引起ERK1/2磷酸化,但以前的研究均没有阐述是否存在上皮生长因子受体间接激活。最近研究发现,小脑的颗粒细胞突触上存在谷氨酸NMDA受体和PKC依赖性的LTP。在对小脑切片有关的神经递质释放与钙离子动力学的研究表明,谷氨酸受体激活后引起大量Ca2+进入细胞内,使电压依从Ca2+通道开放,进一步释放游离Ca2+,从而使细胞游离Ca2+增加。另外,小脑的颗粒细胞的激活并不依赖突触的刺激,而主要通过树突电压依从性的钙通道开放,使细胞游离Ca2+增加引起的。上述发现提示,谷氨酸受体介导和去极化诱导的ERK1/2磷酸化在小脑颗粒神经元的重要性,但有关PKC在其中的具体作用目前还不很清楚。结论原代培养7-8天小鼠小脑颗粒神经元,高钾引起ERK1/2磷酸化,该过程依赖于谷氨酸的释放和谷氨酸NMDA和非NMDA受体调节。高钾去极化引起小脑颗粒神经元谷氨酸的释放激活金属蛋白酶,活化的金属蛋白酶水解HB-EGF（可能包括TGF-α）的脱落,进而激活EGFR,导致ERK1/2磷酸化。