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研究背景和意义视网膜新生血管性疾病是危害视力,致盲的重要疾病之一。目前普遍认为视网膜局部缺氧状态是诱导视网膜新生血管形成的主要原因之一,其发病机制研究是国内外的研究热点。研究证实缺氧刺激下多种转录因子活性增加可促进微血管内皮细胞活化,导致新生血管形成,其中除血管内皮生长因子(VEGF)外,特殊蛋白1(SP1)和缺氧诱导因子1-α(HIF1-α)的血管生成作用也逐渐受到关注。近几年研究发现,VEGF的启动子上存在SP1和HIF1-α结合位点,从而可被其调控引起转录增强;除此之外,课题组研究发现,缺氧诱导下腺苷水平与人微血管内皮细胞(HMEC-1)的活化相关,而SP1和HIF1-α已被证实可以调节腺苷生成的关键核苷酸酶:三磷酸腺苷酶(CD39)和5′核苷酸酶(CD73)。本课题希望通过证实同时干扰SP1和HIF1-α基因可以较单基因干扰SP1/HIF1α或传统抗VEGF药物(雷珠单抗注射液),更能有效抑制人微血管内皮细胞(HMEC-1)活化,从而为进一步治疗视网膜新生血管性疾病提供新的方法。目的:1、证实缺氧诱导模型下,HMEC-1细胞株SP1和HIF1-α表达水平增高,且通过单因素或双因素siRNA干扰能成功抑制缺氧下细胞内SP1或/和HIF1-α的表达。2、证实联合干扰较单因素干扰是否更能有效抑制缺氧诱导下的HMEC-1细胞株活化效应。3、证实联合干扰效应是否是通过抑制VEGF促血管内皮细胞活化通路的同时抑制CD39和CD73激活腺苷促血管内皮细胞活化通路而产生。4、证实联合干扰较临床抗VEGF药物(雷珠单抗注射液)是否更能有效抑制缺氧诱导下的HMEC-1细胞株活化效应。方法:1、将实验分为缺氧组(缺氧培养箱:37℃,体积分数1%O2,94%N2和5%CO2)和常氧组(常氧培养箱:37℃,体积分数5%CO2),培养时间分别为12小时和24小时,通过Western blot法检测缺氧诱导模型下人HMEC-1细胞株SP1和HIF1-α表达水平,是否高于常氧状态;再通过该检测法验证单因素或联合siRNA干扰是否能成功抑制缺氧下HMEC-1细胞株SP1或/和HIF1-α的表达。2、将实验分为缺氧组、常氧组、si RNA-Control组(Control-si)、siRNA-SP1组(SP1-si)、siRNA-HIF1-α组(HIF1-α-si)、siRNA-联合干扰组(SP1-si+HIF1-α-si),培养时间为24小时,通过细胞计数试剂盒-8(CCK8),EDU法和Transwell法,比较SP1或HIF1-α单因素干扰以及SP1和HIF1-α联合干扰对缺氧诱导下的HMEC-1细胞株活化的抑制效应。3、将实验分为si RNA-Control组、si RNA-SP1组、si RNA-HIF1-α组、si RNA-联合干扰组,缺氧下培养24小时,通过Western blot法和免疫荧光法,观察联合干扰对VEGF促血管内皮细胞活化通路的抑制以及CD39和CD73激活腺苷促血管内皮细胞活化通路的抑制作用。4、将实验分为si RNA-联合干扰组、抗VEGF组(0.5mg/ml雷珠单抗注射液),缺氧下培养24小时,通过细胞计数试剂盒-8(CCK8),EDU法和Transwell法,比较SP1和HIF1-α联合干扰以及传统抗VEGF药物(雷珠单抗注射液)对缺氧诱导下的HMEC-1细胞株活化的抑制效应。结果:1、缺氧模型中,HMEC-1细胞株SP1和HIF1-α表达水平高于常氧组,且随时间增加,表达量增加;在HMEC-1细胞株加入SP1或/和HIF1-αsi RNA可有效抑制缺氧下其在细胞内的表达。2、缺氧模型中,HMEC-1细胞株活化效应高于常氧组;且对缺氧诱导下的HMEC-1细胞株活化的抑制效应,siRNA-联合干扰组高于si RNA-SP1组和siRNA-HIF1-α组;3、缺氧模型中,加入SP1或/和HIF1-αsiRNA后,可以有效抑制HMEC-1细胞株中的VEGF表达,以及CD39、CD73和腺苷的表达,且抑制效应si RNA-联合干扰组高于si RNA-SP1组和si RNA-HIF1-α组。4、缺氧模型中,siRNA-联合干扰组对HMEC-1细胞株活化效应的抑制作用较抗VEGF组(0.5mg/ml雷珠单抗注射液)更明显。结论:上述结果显示,缺氧诱导下,HMEC-1细胞株中SP1和HIF1-α表达水平增高,加入si RNA干扰SP1或/和HIF1-α基因,可通过抑制细胞中的VEGF表达以及CD39、CD73和腺苷的表达,使细胞活化效应明显降低,且联合干扰效应较单因素干扰效应以及传统抗VEGF(0.5mg/ml雷珠单抗注射液)抑制更明显。因此我们认为,SP1和HIF1-α基因对缺氧状态下人微血管内皮细胞活化有重要作用,可进一步研究双靶点干扰效应,使之成为治疗视网膜新生血管性疾病的新治疗方式。