论文部分内容阅读
小豆是我国传统的杂粮作物,是部分地区农民增收的重要来源,且在农业种植业结构调整的大背景下,小豆等杂粮作物的种植面积呈逐年增加趋势,黑龙江省是我国小豆种植面积最大的区域。然而,由豇豆单胞锈菌引起的小豆锈病在我国各小豆种植区普遍发生,课题组近年来的调查发现,黑龙江西部小豆产物该病害发生严重,已成为威胁小豆优质高产的重要因素之一。选育和利用抗病品种是防治作物锈病最为经济有效的措施之一,然而,有关小豆抗锈病基因及小豆抗锈病机理方面的研究相对滞后,致使缺少成熟的理论和技术成果用于小豆锈病的防治实践。因此,本研究拟利用RNA-Seq测序技术挖掘小豆抗锈病相关基因,筛选适宜于小豆基因表达分析的内参基因及qRT-PCR技术体系,在此基础上对候选的小豆抗锈病相关基因在病菌侵染不同阶段的表达模式进行分析,初步明确参与小豆抗锈病的基因,并对抗病相关基因VaEG45的功能进行初步分析,为深入探索小豆抗锈病分子机理及病害防控奠定基础。研究取得以下重要结果:1.利用转录组测序技术,分析了小豆抗病品种‘庆红1号’（QH1）在豇豆单胞锈菌接种后不同时间（24 h和48 h）的全转录组,以接种无菌水为对照,4个处理3次生物学重复计12个测序样本,共获得0.38-0.54 Gb不等的clean reads,经基因组mapping后进行差异表达基因分析,结果表明,接种后24 h共鉴定差异表达基因2973个,接种后48 h共鉴定差异表达基因856个,表明在病菌入侵早期即可显著诱导小豆产生防卫反应。差异表达基因的功能注释表明,接种后24 h,多个PR蛋白呈显著上调表达趋势。GO和KEGG富集分析发现,受病菌侵染后,小豆乙烯生物合成及乙烯信号通路的多个关键基因（ACS和ACO）及相关转录因子（ERF096、ERF1b、ERF110、ERF113、EBF1）被激活,表明锈菌侵染可能引起了小豆内源乙烯含量的改变,进而激活了乙烯抗病信号通路,这可能是小豆品种QH1高抗锈病的重要因素。2.为构建适宜小豆基因表达的qRT-PCR技术体系及稳定内参,选取了9个常用的管家基因为候选内参,对候选内参基因在不同试验条件下表达稳定性进行了分析,试验结果表明,在不同小豆品种中,可选择ACT或PTB作为内参基因;在同一品种不同组织器官中,可选择EF或UBN作为内参;在接种锈菌和干旱胁迫条件下,ACT或ZMPP可作为内参基因;在盐碱胁迫条件下,可选择UBC或Fbox作为内参;在淹水胁迫条件下,可选择PTB或Fbox作为内参基因。为进一步确定本研究筛选的内参基因的可靠性,分别以ACT、基因组合UNC+UBN、UBC+UBN+EF以及PP2A为内参,对抗病相关基因CAT、CHI及GLU在小豆响应锈菌侵染过程中的表达模式进行了分析,结果表明,接种锈菌条件下以ACT为内参可准确评估候选3个抗病相关基因的表达水平,说明经本研究筛选获得的内参基因较为可靠,可用于小豆基因在相应试验条件下的表达分析。3.应用前文建立的小豆qRT-PCR分析体系及筛选获得的最适内参,以抗、感不同品种接种锈菌后不同时间的叶片为材料,对转录组测序鉴定的于接种后显著差异表达的2个抗病相关基因（VaNATA1和VaEG45）的表达模式进行了分析,结果表明,与感病品种相比,VaNATA1和VaEG45在抗病品种中受病菌侵染后被显著诱导表达,其中VaNATA1在病菌侵染早期（接种后12 h-24 h）和后期（120 h）显著上调表达,而VaEG45主要在病菌侵染后期（接种后48 h-120 h）显著上调,表明VaNATA1参与了对病菌入侵和扩展的抑制作用,而VaEG45只参与了对病菌扩展的抑制。上述结果表明,以转录组测序为依据,结合qRT-PCR分析初步明确了VaNATA1和VaEG45的表达水平与小豆抗锈病呈正相关。4.采用RT-PCR技术,克隆了抗病相关基因VaEG45,对其氨基酸序列分析的结果表明,VaEG45属于植物利钠肽家族基因,包含一个DPBB1功能域,是一个分泌型胞外蛋白。在烟草中瞬时表达后发现,瞬时表达VaEG45的烟草叶片的病斑直径显著降低,比对照降低了近40%,表明该基因显著提高了烟草对灰霉菌侵染的抗性。进一步应用胼胝质染色技术分析发现,VaEG45基因瞬时表达,可诱发烟草叶肉细胞出现胼胝质沉积,推测VaEG45可能通过增强细胞壁的机械强度从而提高烟草对灰霉菌的抗性。