脑缺血类疾病是重症病房和外科手术常见病，对于长时间低血压、休克以及心跳骤停的患者，尽管呼吸心跳恢复正常，但常遗留了不同程度的脑机能障碍，都涉及到脑缺血再灌注损伤。同时在我国每年约有150万新发脑血管病患者，其中最常见类型也是缺血性脑卒中[1]。目前对脑缺血性疾病的发病机制的研究正不断深入，但其确切机制尚未完全阐明，还没有令人满意的治疗措施。　　 脑缺血发生后，梗死灶周围存在着缺血半暗带区，这一区域结构完整，但是功能受损，是目前脑缺血后神经功能恢复的治疗靶点[2]。临床研究表明脑缺血后血管新生明显的患者神经功能恢复的效果也明显好于血管新生差的患者，因此缺血半暗带区新生血管的形成及其机制成为关注的焦点之一[3]。对神经血管再生相互联系可能机制的进一步研究有助于深化对脑缺血后修复再生过程的统一认识。在缺血性脑血管病的临床治疗中将神经干细胞和内皮细胞、神经发生和血管生成结合起来，促进“神经血管单元”的协调和优化是今后努力的方向[4]。　　 神经和血管虽然表面上看似不同，但在神经血管的形成中具有一些深层次的相似性。一些轴突生长导向因子通过调节轴突生长时的吸引排斥信号影响轴突生长，同时最近的研究还表明这种信号调控也有助于血管的再生;同样一些调控血管新生的生长因子也可对轴突生长起调节作用[5]。神经网络和血管网络复杂而有序的分布以适应中枢神经系统的功能，作为脑缺血后同一修复再生过程的不同方面，神经发生和血管生成在缺血后同时被启动，并被精密、协调、统一地调控[6]。Slit是发现的第一种对神经生长和神经元迁移都有导向作用的因子，对轴突生长有着排斥性导向作用，促进轴突向正确的方向延伸，同时对神经元的迁移也有导向作用，因此可促进神经突触形成和正确行使突触功能[7]。Slit有3种亚型(Slit1-3)，可与其跨膜受体Roundabout(Robo)蛋白家族相结合。目前生物体内已发现4个编码Robo的基因，Robo属于神经细胞黏附分子，是单通道的跨膜受体，主要表达于神经系统，也见于其他组织[8]。在Robo受体家族的研究中，Robo1、Robo4参与的神经血管新生备受关注。但是关于脑缺血后Slit及其受体Robo的表达及功能研究尚未见报道，因此本实验首先研究脑缺血再灌注后Slit/Robo的表达情况及与神经血管新生的相关关系，明确Slit/Robo的表达改变对神经功能恢复的影响;其次进一步改变内源性Slit/Robo通路，探讨对脑缺血后神经和血管再生的影响及其机制;最后给予外源性Slit，研究其对脑缺血后脑神经元和血管的保护效应，为脑缺血性疾病的治疗提供依据。　　 材料与方法：　　 一、大鼠局灶性脑缺血再灌注后Slit/Robo表达的研究　　 （一）实验材料　　 1、动物:雄性SD大鼠，体重250-300克。　　 2、主要试剂:兔抗Slit2多克隆抗体，兔抗Robo1多克隆抗体，兔抗Robo4多克隆抗体，SABC试剂盒，羊抗兔IgG多克隆抗体，兔抗β-actin多克隆抗体，BCA蛋白浓度测定试剂盒，ECL试剂盒，Real time RT-PCR试剂盒。　　 3、主要仪器:恒冷冰冻切片机，分光光度计，电泳仪，转印仪，Real-timePCR扩增仪。　　 （二）实验方法　　 1、线栓法制备大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型。　　 2、神经功能缺损评分，分析缺血再灌注后不同时段神经功能的恢复过程。　　 3、免疫组织化学法和Western-blot法测定脑缺血周围组织和海马区Slit2、Robo1和Robo4的蛋白表达水平变化，探讨与神经功能变化的相关关系。　　 4、Real-time PCR法检测Slit2、Robo1和Robo4的mRNA在脑缺血周围组和海马区的表达，探讨与神经功能变化的相关关系。　　 二、Slit对大鼠脑缺血再灌注后神经功能和神经血管新生的作用和机制　　 （一）实验材料　　 1、动物:雄性SD大鼠，体重250-300克。　　 2、主要试剂:Slit2，Robo1抗体，Robo4抗体，红四氮唑，BrdU，兔抗BrdU多克隆抗体，TUNEL试剂盒，兔抗CD34多克隆抗体，SABC免疫组化试剂盒。　　 3、主要仪器:恒冷冰冻切片机，脑立体定位仪。　　 （二）实验方法　　 1、线栓法制备大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型。　　 2、脑立体定位仪定位下脑室置管给药。　　 3、红四氮唑染色和图像分析检测脑缺血梗死体积百分比，分析Slit对脑梗死体积的影响。　　 4、神经功能缺损评分，分析Slit对神经功能变化的影响。　　 5、干湿重法测定脑缺血后脑水肿程度，分析Slit的脑保护效应和机制。　　 6、TUNEL染色检测神经元凋亡数量，分析Slit对神经元保护效应和机制。　　 7、用BrdU标记新生神经元检测神经元再生情况，分析Slit对神经元的保护效应和机制。　　 8、用CD34标记血管检测血管新生情况，分析Slit对血管内皮细胞的保护效应和机制。　　 实验结果：　　 一、大鼠局灶性脑缺血再灌注后Slit/Robo表达的研究　　 1、脑缺血再灌注后，神经功能缺损评分随着再灌注时间的延长逐渐降低，神经功能逐渐恢复。　　 2、免疫组织化学染色法表明脑缺血再灌注后缺血周围组织和海马区Slit2和Robo1的蛋白表达增强，而Robo4的蛋白表达无明显变化，可能与促进缺血后神经功能的恢复有关。　　 3、Western-blot法检测也表明缺血后缺血周围组织和海马区Slit2和Robo1的蛋白表达增强，而Robo4的蛋白表达无明显变化，可能与促进缺血后神经功能的恢复有关。　　 4、Real-time PCR法检测表明缺血后缺血周围组织和海马区Slit2和Robo1的mRNA表达增强，而Robo4的mRNA表达无明显变化，可能与促进缺血后神经功能的恢复有关。　　 二、Slit对大鼠脑缺血再灌注后神经功能和神经血管新生的作用和机制　　 1、脑室注射Robo1抗体、Robo4抗体或Slit2对脑缺血后的脑梗死体积无明显影响。　　 2、脑室注射Robo1抗体和Robo4抗体可增加脑缺血后的神经功能缺损以及脑水肿。　　 3、脑室注射Robo1抗体和Robo4抗体可促进脑缺血后的神经元凋亡，抑制神经元和血管的新生。　　 4、脑室注射Slit2后可明显降低脑缺血后的神经功能缺损评分，同时明显降低脑水肿程度。@25、脑室注射Slit2后可明显减少脑缺血后的神经元凋亡，增加神经元和血管的新生。　　 6、脑室同时注射Slit2和Robo1抗体和/或Robo4抗体后，可明显抑制Slit2引起的神经功能保护效应和神经血管新生作用。　　 结论：　　 1、脑缺血再灌注后，脑梗死周围区和海马区神经导向因子Slit2及其受体Robo1的mRNA和蛋白表达均增高，与神经功能的逐渐恢复密切相关，推测Slit2及其受体Robo1对脑缺血再灌注损伤后神经功能的恢复可能起促进作用，可能与Slit2的促进脑血管新生、促进神经元的存活有关。　　 2、脑室注射Robo1抗体和Robo4抗体可增加脑缺血后的神经功能缺损和脑水肿，促进神经元凋亡，抑制缺血后神经元和血管新生;研究表明内源性Slit2可能是通过Robo1和Robo4受体起到脑保护效应。　　 3、脑室注射外源性Slit2可降低脑缺血后的神经功能缺损和脑水肿，可以减少神经元凋亡，促进神经元和血管新生;同时给予外源性Slit2、Robo1抗体和Robo4抗体可以抑制外源性Slit2的脑保护作用;研究表明外源性Slit2可能是通过Robo1和Robo4受体通路起到脑保护效应的。