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牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea,BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）引起的牛的一种临床症状复杂多样,可在牛群中持续感染的重要牛病毒性传染病之一。由于BVDV独特的致病机制能够造成宿主的免疫抑制,从而导致免疫失败以及其它呼吸道传染病的发生。同时,被BVDV感染的牛群,其繁殖、产肉、产奶等生产性能会受到极大地影响,进而引起严重的经济损失。目前,预防BVD主要采用疫苗接种,包括弱毒疫苗和灭活疫苗。出于对弱毒疫苗的安全性考虑,免疫接种仍以灭活疫苗为主,但由于BVDV易发生突变,灭活疫苗应对病毒突变的能力差,常常导致免疫失败。因此,研制能够有效预防BVDV感染的新型疫苗对防控牛病毒性腹泻病具有重要意义。本研究基于BVDV主要经消化道黏膜感染的特点,诱导机体产生有效的保护性黏膜免疫应答可构筑机体抵抗BVDV经黏膜感染的第一道防线为指导思想实施课题研究,选择BVDV保护性抗原E2蛋白为免疫原及霍乱毒素B亚单位（CTB）为免疫佐剂,利用干酪乳杆菌作为抗原传递载体,构建融合表达BVDV E2蛋白和CTB的基因工程乳酸菌,经口服途径免疫动物,探索该重组乳酸菌系统作为口服黏膜免疫制剂的免疫原性,以期为防控牛病毒性腹泻病新型疫苗的研发提供理论依据。本论文的具体研究内容如下:第一,分别构建了组成型表达BVDV E2蛋白和组成型融合表达BVDV E2蛋白与CTB的基因工程乳酸菌。提取BVDV基因组RNA并反转录成cDNA,以cDNA为模板PCR扩增E2基因,同时提取霍乱弧菌基因组DNA,经PCR扩增ctxB基因,将PCR产物依次连入pMD-19T simple载体,分别构建出重组质粒pMD-19Ts-E2’和pMD-19Ts-E2-ctxB,并测序分析;利用Sac I和Apa I分别对重组质粒pMD-19Ts-E2’和pMD-19Ts-ctxB进行双酶切处理,将目的基因E2和E2-ctxB片段分别连入干酪乳杆菌组成型表达载体pPG-T7g10-PPT相应酶切位点处,构建出重组表达质粒pPG-E2和pPG-E2-ctxB,然后通过电转化方法将重组表达质粒分别转入干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）W56中,经PCR和测序鉴定,成功构建出重组干酪乳杆菌pPG-E2/Lc W56和pPG-E2-ctxB/Lc W56;采用Western blot方法和间接免疫荧光方法鉴定目的蛋白的表达,鉴定结果显示,目的蛋白E2和融合蛋白E2-CTB获得了组成型表达,并展示于重组菌菌体表面。第二,初步建立了BALB/c小鼠口服感染BVDV模型。BALB/c小鼠经口服途径攻毒300μL滴度为105.3/0.1mL（TCID50）的CP型BVDV,每天收集小鼠粪便样品,通过RT-PCR方法检测小鼠排毒情况,持续监测60 d,结果显示,小鼠攻毒2 h后即可在其排泄的粪便中检测出BVDV,在为期60 d的监测中,小鼠可持续排出BVDV,表明BVDV可在小鼠肠道内进行有效繁殖;利用小鼠体温测量仪进行为期15 d的小鼠体温持续监测,结果显示,与对照组小鼠相比,攻毒组小鼠体温攻毒后出现下降,于攻毒后第3 d开始体温逐渐上升并出现“稽留热”最后恢复至正常水平;攻毒后15 d,采集小鼠肺脏、肝脏、肾脏、心脏、脾脏和小肠,分别进行组织病理学观察和病毒载量检测,结果显示,攻毒前后小鼠各脏器无明显病理学变化,同时在脾脏、肺脏和小肠中检测出BVDV的存在,且病毒载量逐渐升高,至攻毒第7 d后水平趋于稳定。第三,以BALB/c小鼠为动物模型,系统地评价了重组干酪乳杆菌的免疫原性以及CTB的佐剂效应。将BALB/c小鼠随机分为四组（每组35只）,包括pPG-E2/Lc W56组（试验组）、pPG-E2-ctxB/Lc W56组（试验组）及pPG/Lc W56组（对照组）和PBS组（对照组）。免疫程序如下:试验组小鼠每只口服免疫200μL浓度为10100 CFU/mL的重组乳酸菌,对照组小鼠口服同等剂量的空载体乳酸菌和PBS,共免疫3次,免疫时间间隔2 w,每次连续免疫3d。分别于免疫前和免疫后不同时间点采集各组小鼠的粪便、肠黏液、阴道冲洗液和鼻液样本,采用间接ELISA方法检测sIgA抗体水平,结果显示,试验组小鼠于初免后第14 d开始,特异性sIgA抗体水平呈现显著上升,而对照组的sIgA抗体水平免疫前后无差异,表明构建的两株重组乳酸菌能够有效诱导机体产生基于抗原特异性sIgA的肠道黏膜免疫应答,并引起“共黏膜”免疫效应,且诱导产生的sIgA抗体具有中和BVDV活性。采集各组小鼠血清,采用间接ELISA方法检测IgG抗体水平,检测结果显示,与对照组相比,试验组小鼠于第二次免疫后诱导机体产生了显著水平的IgG抗体,表明构建的重组乳酸菌可诱导机体产生基于抗原特异性IgG的体液免疫应答,且诱导产生的IgG抗体具有中和BVDV活性。其中,重组乳酸菌pPG-E2-ctxB/Lc W56诱导机体产生的抗原特异性sIgA和IgG抗体水平显著于pPG-E2/Lc W56试验组,表明霍乱毒素B亚单位CTB能够显著增强重组乳酸菌的口服免疫效果,显示了良好的佐剂效应。试验组小鼠脾淋巴细胞增殖实验及CD4+、CD8+T淋巴细胞水平的检测结果显示,构建的重组干酪乳杆菌可诱导机体产生细胞免疫应答,通过血清中细胞因子的水平检测,结果表明重组干酪乳杆菌能够刺激机体产生Th1、Th2及Th17型细胞免疫,以Th2型细胞免疫为主。其中,重组乳酸菌pPG-E2-ctxB/Lc W56诱导细胞免疫应答能力显著于pPG-E2/Lc W56。第四,利用建立的BALB/c小鼠感染BVDV动物模型,初步评价了构建的重组乳酸菌口服免疫保护效果。在初免后第35 d（即三免后第7 d）,各组小鼠经口服途径攻毒300μL滴度为105.3/0.1mL（TCID50）的CP型BVDV,每天收集各组小鼠的粪便样品,检测小鼠肠道内病毒的清除情况,结果显示,试验组小鼠所排粪便中病毒含量逐渐减少,其中口服免疫pPG-E2/Lc W56组小鼠的粪便中从攻毒后第6 d开始已检测不出BVDV的存在,口服免疫pPG-E2-ctxB/Lc W56组小鼠排泄的粪便中从攻毒后第4 d开始已检测不出BVDV,而对照组小鼠排泄的粪便中可持续检测出病毒的存在,结果表明攻毒后试验组（pPG-E2/Lc W56组和pPG-E2-ctxB/Lc W56组）小鼠肠道内的BVDV均被很快清除;同时,试验组（pPG-E2/Lc W56组和pPG-E2-ctxB/Lc W56组）小鼠脾脏、肺脏和血液中病毒载量也逐渐减少,其中免疫pPG-E2-ctxB/Lc W56组小鼠组织中的病毒载量下降明显,而对照组小鼠各组织中病毒载量始终保持较高水平;此外,未见各组小鼠组织的病理学变化。以上实验结果表明,口服免疫重组乳酸菌pPG-E2/Lc W56和和pPG-E2-ctxB/Lc W56能够对免疫动物提供有效的抗病毒保护,其中口服免疫pPG-E2-ctxB/Lc W56的保护效果更好。第五,本研究采用流式细胞术和免疫组化方法初步探究了口服重组干酪乳杆菌对肠道黏膜sIgA抗体分泌的影响。以BALB/c小鼠为动物模型,分为pPG-E2/Lc W56免疫组（试验组）、pPG-E2-ctxB/Lc W56免疫组（试验组）、pPG/Lc W56免疫组（对照组）和PBS组（对照组）,试验组小鼠每只口服免疫200μL浓度为10100 CFU/mL的重组干酪乳杆菌,对照组小鼠口服同等剂量的空载体菌和PBS液,连续免疫3 d,免疫后第7 d分离各组免疫小鼠肠道Peyer’s集合淋巴结进行Bcl-6+和IgA+免疫组化检测,结果显示,PBS组未见标记明显的Bcl-6+和IgA+细胞,pPG/Lc W56免疫组可见少量Bcl-6+和IgA+细胞,pPG-E2/Lc W56和pPG-E2-ctxB/Lc W56免疫组可见数量较多的Bcl-6+和IgA+细胞,且pPG-E2-ctxB/Lc W56免疫组Bcl-6+和IgA+细胞数多于pPG-E2/Lc W56免疫组。同时,制备各免疫组小鼠肠道Peyer’s结淋巴细胞悬液,经流式抗体标记分别检测Tfh细胞、B220+IgM+淋巴细胞、B220+IgA+淋巴细胞和B220-IgA+浆母细胞的百分率,结果显示,与PBS对照组相比,pPG/Lc W56免疫组、pPG-E2/Lc W56免疫组和pPG-E2-ctxB/Lc W56免疫组小鼠Peyer’s小结中Tfh细胞百分率、B220+IgM+淋巴细胞百分率、B220+IgA+淋巴细胞百分率和B220-IgA+浆母细胞百分率均有明显升高,其水平由低到高依次为pPG/Lc W56组、pPG-E2/Lc W56组和pPG-E2-ctxB/Lc W56组,尤以pPG-E2-ctxB/Lc W56免疫组升高最为显著,表明本研究构建的重组干酪乳杆菌pPG-E2/Lc W56和pPG-E2-ctxB/Lc W56能够有效地促进肠道Peyer’s中B淋巴细胞的增殖、成熟以及分化（IgA+浆细胞）,进而诱导黏膜sIgA分泌,诱导效果尤以pPG-E2-ctxB/Lc W56最为显著,同时证实BVDV E2蛋白具有良好的免疫原性以及霍乱毒素B亚单位ctxB具有良好的佐剂活性,也证实本研究选用的干酪乳杆菌W56具有良好的促机体非特异性免疫作用。综上所述,本研究成功构建了以霍乱毒素B亚单位CTB为佐剂组成型融合表达BVDV保护性抗原E2蛋白和CTB的重组干酪乳杆菌pPG-E2-ctxB/Lc W56,经口服途径免疫动物,结果表明构建的基因工程乳酸菌具有良好的免疫原性和免疫保护作用,为进一步研发牛病毒性腹泻病新型口服黏膜疫苗提供理论与物质基础。