论文部分内容阅读
溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)是第二代鱼尼丁受体抑制剂类杀虫剂。溴氰虫酰胺具有适用作物更广泛、更高效等优点,可有效防治鳞翅目、半翅目和鞘翅目害虫,且溴氰虫酰胺具有内吸性、渗透和传导作用,可分布于整个植株。其高效、速效、持效期长。随着溴氰虫酰胺在全球覆盖率的增加,其使用量也逐渐增加,其对环境风险也不断提高,目前缺乏溴氰虫酰胺对罗非鱼幼鱼的毒性评价,毒性机理尚不明确。溴氰虫酰胺对斑马鱼影响的研究已有报道,本实验室已经确定溴氰虫酰胺会造成斑马鱼眼部细胞凋亡,对其造成这一现象的机理进行深入探究。本论文以罗非鱼幼鱼和斑马鱼胚胎为试验材料,评价溴氰虫酰胺对罗非鱼幼鱼的毒性,以及其造成斑马鱼眼部细胞凋亡的机理。实验结果如下:一、溴氰虫酰胺原药对罗非鱼幼鱼的影响1溴氰虫酰胺原药对罗非鱼幼鱼的急性毒性96h-LCso为37.82 mg·L-1,属于低毒毒性。在慢性毒性试验中,溴氰虫酰胺会抑制罗非鱼的生长发育,且随着时间的推移抑制越明显。到28天时,空白对照、溶剂对照、0.037mg·L-1、0.37mg·L-1和3.7mg·L-1处理组的生长速率分别为 1.137%/d、0.948%/d、0.932%/d、0.819%/d、0.698%/d。其中空白对照组的生长速率较快,3.7mg·L-1处理组的生长速率较慢,二者之间存在显著性差异(p<0.01);2在慢性试验中,使用DAPI染色和单细胞凝胶电泳(single cell electrophoresis,SCGE)两种方法检测溴氰虫酰胺对罗非鱼幼鱼肝脏细胞DNA损伤。结果表明,随着溴氰虫酰胺浓度的增加,微核率显著增加(p<0.01);彗星的尾长、尾距和尾部DNA含量都显著增加(p<0.01),说明溴氰虫酰胺诱导罗非鱼幼鱼肝脏细胞DNA损伤,且呈较好的剂量-效应关系;3用RT-qPCR技术研究溴氰虫酰胺对罗非鱼幼鱼肝脏细胞DNA损伤相关基因的影响。结果表明,当溴氰虫酰胺浓度为0.037mg·L-1时,即引起罗非鱼肝脏细胞的DNA损伤,激活DNA损伤与修复通路,同时也激活了细胞对DNA的修复。溴氰虫酰胺主要影响的基因是Ccna和1Rpa3;4通过对溴氰虫酰胺处理的罗非鱼幼鱼肝脏细胞内抗氧化酶系活力的研究,发现溴氰虫酰胺暴露后,罗非鱼肝脏细胞内活性氧(ROS)含量、丙二醛(MDA)含量增加,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)与过氧化物酶(POD)三种抗氧化物酶的活力升高。该结果表明,由于溴氰虫酰胺的暴露激活了肝脏细胞氧化应激反应,促进胞内抗氧化酶系活力增加。二、溴氰虫酰胺原药对斑马鱼的眼部细胞凋亡机理初探1从转录组测序的结果中可知,在斑马鱼眼部细胞凋亡通路中有明显变化且关联较强的基因有pvalb1、rbl2、vax2、bmp4、pitx1、lmx1a、cyp1b1和b2m,其中pvalb1和rbl2上调最明显。用RT-qPCR技术研究溴氰虫酰胺对斑马鱼眼部细胞凋亡相关的基因pval61、rbl2、vax2、bmp4、xpitx1、lmx1a、cyp1b1和 结果表明,这些凋亡相关基因的mRNA表达量均上调,其中rbl2的变化最大。这些结果表明,溴氰虫酰胺会影响斑马鱼细胞凋亡通路的基因表达;2使用酶联反应试剂盒,检测溴氰虫酰胺暴露后24hpf斑马鱼胚胎rb12蛋白表达水平。最高浓度处理组(2.00 mg·L-1)中检测到的rb12蛋白含量为7.41pg·mL-1,与对照组(3.54pg·mL-1)存在显著差异(p<0.01)。该结果表明溴氰虫酰胺会影响rbl2蛋白的表达;3采用CRISPR/Cas9基因敲除技术,对斑马鱼进行基因编辑。根据转录组和RT-qPCR的结果,选择rbl2做为敲除基因。注射后的胚胎正常饲养至性成熟,剪尾测序,测序结果表明本次敲除成功,为后续试验奠定了基础。