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乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）属于黄病毒科黄病毒属,侵入中枢神经系统能引起急性感染,导致脑部炎症和神经损伤,是一种危害严重的人兽共患虫媒性传染病病原。全球每年乙型脑炎病例为5～10万人,约25%～30%死亡,而50%幸存者留下永久性中枢神经系统（CNS）后遗症。JEV也引起猪的繁殖障碍和神经损伤,每年给养猪业带来了巨大的经济损失。JEV感染机体后可经脊液或内皮细胞、吞噬细胞、淋巴细胞感染或血源路线突破血脑屏障,侵入CNS并在脑组织内大量增殖,产生炎性因子以及诱导一系列级联反应,引起临床发病而呈现神经症状。TRIM家族蛋白为宿主限制性因子,在天然免疫方面发挥重要作用,可以调节天然免疫通路和影响病毒的增殖。研究表明TRIM8在炎症因子产生中发挥一定的作用,但是TRIM8在JEV致脑炎中是否具有一定功能并不清楚。鉴于此,我们开展TRIM8对JEV增殖以及在JEV感染机体过程中产生炎性因子影响的研究。具体研究内容如下:1.TRIM8对JEV增殖的影响为了探讨TRIM8与JEV复制的相关性,用5.0 MOI的JEV SX09s-01感染U251和293T细胞,感染后不同时间点收集感染细胞,通过荧光定量PCR检测TRIM8的表达情况,结果显示JEV感染后TRIM8在m RNA水平均有上调,且随着感染时间的延长,表达量呈上升趋势。另外,用3×10~5PFU的JEV SX09s-01接种小鼠,在感染后5天左右小鼠发病,收集小鼠的脑组织,结果显示JEV感染后脑组织中TRIM8也有显著的上调（p＜0.001）。以上结果表明TRIM8在JEV感染过程中可能发挥一定作用。将pTRIP-TRIM8-3Flag和pTRIP-TRIM8?R-3Flag转染U251细胞,24h后用1.0MOI的JEV SX09s-01感染,24h后收集细胞样品。荧光定量结果显示,在TRIM8过表达时,JEV核衣壳C基因的m RNA水平明显降低（p＜0.01）,而缺失RING时没有影响。Western blot结果也显示TRIM8过表达时,JEV E蛋白的表达量明显降低,RING缺失时对E蛋白的表达没有影响。结果表明TRIM8能抑制JEV在U251细胞中增殖,而且RING是主要功能域。同样,通过sh RNA沉默U251细胞内源性的TRIM8后,JEV的增殖有较明显的上调,也表明TRIM8能抑制JEV的增殖。另外,在293T细胞上过表达及沉默内源性TRIM8后,用1.0 MOI的JEV SX09s-01感染。荧光定量、Western blot和蚀斑试验结果均表明TRIM8能有效抑制JEV的增殖,与U251细胞结果一致。2.TRIM8对JEV诱导I型干扰素通路的影响为了探讨TRIM8是否通过上调I型干扰素的产生而发挥抑制JEV增殖效应,首先用5.0 MOI JEV SX09s-01感染293T细胞,感染后不同时间收集细胞,通过荧光定量PCR检测IFN-β的表达变化,结果显示JEV感染后IFN-β在m RNA水平上调,且随着感染时间的延长,表达量呈上升趋势。将pTRIP-TRIM8-3Flag、TRIM8的sh RNA（sh TRIM8）转染293T细胞,24h后用5.0 MOI JEV SX09s-01感染,24h后收集细胞样品。荧光定量PCR结果显示,过表达TRIM8促进了JEV感染后IFN-β的产生,而通过sh RNA沉默内源性的TRIM8,起到相反的作用。另外,将pTRIP-TRIM8-3Flag、sh TRIM8与IFN-β启动子报告质粒共转染293T细胞,24h后用5.0 MOI的JEV SX09s-01感染,感染后24h收集细胞样品。IFN-β启动子活性的检测结果表明,过表达TRIM8使JEV感染后的IFN-β启动子活性升高,而沉默内源性TRIM8 IFN-β启动子活性下降。这些结果表明TRIM8导致IFN-β上调可能是TRIM8抑制JEV增殖的原因之一。3.TRIM8对JEV感染产生炎性因子的影响5.0 MOI JEV SX09s-01感染U251和293T细胞或者3×10~5PFU JEV接种小鼠后,TNFα和IL-1β的m RNA水平显著上调,且随着时间延长逐步升高,与JEV感染后TRIM8表达趋势一致。另外,用25ng/m L的TNFα、IL-1β处理U251细胞,TRIM8都有显著上调,说明TRIM8与TNFα和IL-1β的产生相关。综上结果表明TRIM8在JEV感染后产生TNFα和IL-1β等炎症因子过程中发挥一定作用。随后,在293T细胞中验证了TRIM8在JEV感染产生炎性因子过程中发挥的作用。pTRIP-TRIM8-3Flag、sh TRIM8转染293T细胞,24h后用5.0 MOI JEV SX09s-01感染,24h后收集细胞样品。荧光定量结果显示,过表达TRIM8上调JEV感染后TNFα和IL-1βm RNA水平,而沉默TRIM8时,结果刚好相反。综上所知,过表达TRIM8能抑制JEV增殖,上调IFN-β的表达可能是抑制JEV增殖的机制之一。另外,TRIM8正调控JEV所致炎性因子如TNFα和IL-1β的表达,从而在JEV致脑炎的病理过程中发挥作用。