论文部分内容阅读
第一部分：大鼠液压冲击伤性脑水肿p38MAPK表达规律及其与AQP4表达变化的关系目的：观察大鼠液压冲击伤性脑水肿p38MAPK表达规律及其与AQP4表达变化的关系。方法：雄性SD大鼠56只，体重250～300g，随机分为对照组（NC组）和外伤组（TBI组），其中TBI组又按伤后1h，6h，12h，24h，3d，7d六个时间点分为6个亚组，每组8只。TBI组动物常规麻醉开颅，制作液压冲击伤动物模型； NC组只行颅骨开窗但不给予液压打击。NC组于术后，TBI组于术后相应时间点进行神经功能评分后，再均以10%水合氯醛过度麻醉，断头处死，开颅取脑，经损伤区切成3mm厚冠状脑片，HE染色行组织形学观察，免疫组织化学染色方法检测AQP4、p38MAPK和p-p38MAPK。从损伤区前缘取100mg左右脑组织应用干湿重法测脑组织含水量。损伤区后缘脑组织矢状分为2部分，其中一份用Western Blot检测AQP4，p38MAPK和p-p38MAPK含量。另一份用RT-PCR检测AQP4mRNA的表达。结果：1神经功能评分: TBI组与NC组比较，在伤后6h评分开始减低（2.875±1.126，P<0.05）；12h（4.375±0.916）较6h有所升高，但仍低于NC组（P<0.05）；24h时评分又出现降低（2.125±0.835，P<0.05）；之后评分逐渐升高，3d神经功能评分（5.75±0.886，P<0.05）仍低于NC组。2组织学观察：TBI组动物动物伤后6h开始出现细胞水肿，12h细胞水肿较前加重，24h时水肿最为明显，可见细胞体积明显增大，胞浆淡染，甚至出现空泡变性，并伴有胶质细胞的增生，3d时水肿程度有所减轻，7d时明显减退，但胶质细胞增生逐渐显著。3大鼠脑含水量TBI组与NC组相比，1h时差异无统计学意义（P>0.05），6h时稍升高（79.54±0.715, P<0.05），12h明显升高（81.89±0.581, P<0.05），24h达到高峰（83.31±1.115, P<0.05），3d开始下降（82.13±0.593，P<0.05），7天明显下降（81.24±1.010，P<0.05）。4免疫组化AQP4主要在星形胶质细胞和室管膜细胞胞膜表达，尤其丰富表达于与毛细血管和软脑摸直接接触的星形胶质细胞足突上。TBI组动物水肿脑组织AQP4于伤后6h（0.424±0.021，P<0.05）开始增高，24h（0.909±0.052，P<0.05）达到高峰，随后逐渐降低。p38MAPK在神经元和神经胶质细胞都有表达,尤其在脑室两侧和脉络丛表达明显,在液压冲击脑损伤后随着时间延长其表达逐渐增强，12h（0.400±0.034，P<0.05），24h（0.585±0.026，P<0.05），3天（0.746±0.040，P<0.05），7天（0.917±0.040，P<0.05）。P-p38MAPK则主要表达于细胞核，在正常脑组织中几乎不表达,液压冲击脑损伤后其表达升高，且变化趋势与AQP4变化趋势相似，6-12h（0.292±0.022，0.499±0.019，P<0.05）逐渐升高，24h（0.911±0.049，P<0.05）达高峰，3天后出现下降（0.666±0.037，P<0.05）。5Western Blot.TBI组与NC组相比，TBI组动物水肿脑组织AQP4蛋白表达从6h开始增高（1.639±0.161, P<0.05），12h （2.303±0.211, P<0.05），24h达到高峰（2.822±0.150, P<0.05），3d时降低（2.112±0.195, P<0.05），7d后明显降低（1.554±0.199），但仍高于正常（P<0.05）。与NC组相比，TBI组动物水肿脑组织P-p38MAPK表达于6h开始逐渐增高（1.581±0.146），24h达到高峰（2.178±0.124, P<0.05），3d时降低（1.913±0.161, P<0.05），7d后明显降低（1.673±0.100），但仍高于正常（P<0.05）。与NC组相比，TBI组动物水肿脑组织p38MAPK表达随时间延长其表达逐渐升高，6h（1.417±0.123），12h（1.755±0.079, P<0.05），24h（2.082±0.106, P<0.05），3d（2.211±0.107, P<0.05），7d（2.373±0.064,P<0.05）6RT-PCRTBI组动物水肿脑组织AQP4mRNA的表达从1h（0.186±0.016）开始增高，6h为（0.422±0.039, P<0.05），12h继续升高（0.620±0.068, P<0.05），24h至3d达到高峰（1.060±0.140,0.739±0.109, P<0.05），7d后降低（0.429±0.088），仍高于对照组（P<0.05）。各亚组间比较均有差异（P<0.05）。6脑含水量与AQP4mRNA、AQP4蛋白和p-p38MAPK表达相关性分析TBI组大鼠脑含水量随AQP4及其mRNA表达的升高而增加，脑含水量与AQP4蛋白及其mRNA之间呈明显正相关(rwestern blot=0.904, r免疫组化=0.935; rm=0.924.，P<0.01)。TBI组大鼠脑含水量随p-p38MAPK表达增加而增加，脑含水量与p-p38MAPK之间呈明显正相关(r免疫组化=0.949，rwestern blot=0.969，P<0.01)。AQP4表达随p-p38MAPK表达增加而增加，p-p38MAPK与AQP4蛋白及其mRNA表达变化之间都呈明显正相关(r免疫组化=0.978; rwesternblot=0.943，P<0.01。结论：1大鼠液压冲击伤性脑水肿AQP4及其mRNA表达呈升高趋势。2大鼠液压冲击伤激活p38MAPK通路，p-p38MAPK表达呈增高趋势。3大鼠液压冲击伤p-p38MAPK表达与AQP4，AQP4mRNA表达呈正相关。4液压冲击伤后调控p38MAPK通路可能是治疗脑水肿的一种新思路。第二部分：p38MAPK特异性抑制剂SB203580对大鼠中度液压冲击伤性脑水肿AQP4表达变化的影响目的：观察p38MAPK特异性抑制剂SB203580对液压冲击伤水肿脑组织AQP4表达变化的影响。方法：雄性SD大鼠152只，体重250～300g，随机分为4组：NC组、单纯损伤组（TBI组）、SBI组和SBII组。后三组再根据伤后1h，6h，12h，24h，3d，7d六个时间点分为6个亚组，每个亚组8只大鼠。SBI组和SBII组分别于术后制作模型前30分钟，在立体定向仪介导下向右侧脑室内注入SB20358010μl,浓度分别为100μmol/L和10mmol/L。NC组不进行液压打击，仅开颅取脑；TBI组、SBI组和SBII组进行液压冲击损伤，并分别于术后第1h、6h、12h、24h、3d和7d于各对应时间点行神经功能学评分，再均以10%水合氯醛过度麻醉，断头处死，开颅取脑，经损伤区切成3mm厚冠状脑片，HE染色行组织形学观察，免疫组织化学染色方法检测AQP4、p38MAPK和p-p38MAPK。从损伤区前缘取100mg左右脑组织应用干湿重法测脑组织含水量。损伤区后缘脑组织矢状分为2部分，其中一份用Western Blot检测AQP4，p38MAPK和p-p38MAPK含量。另一份用RT-PCR检测AQP4mRNA的表达。结果：1神经功能评分与TBI组相比，SBI组和SBII组神经功能评分各时间点均有所增加，差异有统计学意义（P<0.05）。SBI组和SBII组组间比较，仅于12h（4.875±0.835，5.125±0.835）、24h（2.500±0.926，2.75±0.707）、3d（6.125±0.99，6.38±0.744）差别有统计学意义（P<0.05）。与NC组相比，TBI组，SBI组和SBII组除7天（9.000±0.00，8.375±0.744，8.500±0.535，8.625±0.518）外差异有统计学意义（P<0.05）。2组织学观察SBI组和SBII组各个时间点与TBI组比较，脑组织水肿程度有所减轻，范围有所减小，炎细胞渗出减少，胶质细胞增生减弱，神经元周围间隙缩小。SBII组各时间点神经细胞水肿均轻于SBI组。3大鼠脑含水量与TBI组各对应时间点相比较，SBI组和SBII组1h均稍低于TBI组（P>0.05）；6h时明显低于TBI组，差异有统计学意义（P<0.05），SBI组和SBII组间无差别（P>0.05），12h时三组间比较均有差异（P<0.05），脑水含量分别为（81.89±0.58,80.77±0.79,79.48±0.76），24h时脑水含量均达最高，且三组间比较均有差异（P<0.05），脑水含量分别为（83.31±1.11,82.12±0.90,80.92±0.94），3d开始下降，三组间比较同样有差异（82.13±0.59,81.12±0.93,79.94±0.99, P<0.05），7d时明显降低（81.24±1.01，80.35±0.58,78.94±0.67）, SBI组、SBII组仍稍高于TBI组，差异有统计学意义（P<0.05），但SBI组与SBII组组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。4免疫组化与TBI组相比，SBI组和SBII组AQP4蛋白表达在1h差异均无统计学意义（P>0.05），余各时间点均低于TBI组，以12h（0.535±0.027，0.489±0.333，0.583±0.016）、24h（0.856±0.023，0.800±0.038，0.909±0.052）、3d（0.776±0.025，0.708±0.018，0.804±0.016）最为明显（P<0.05）。SBI组和SBII组两组间比较于12h、24h、3d差别有统计学意义（P<0.05）。各组P-p38MAPK表达变化趋势与AQP4变化趋势相似，伤后6h开始增高，24h达到高峰，随后逐渐降低。但与TBI组相比，SBI组和SBII组P-p38MAPK表达于6h（0.265±0.024，0.261±0.020，0.292±0.022）、12h（0.426±0.028，0.350±0.026，0.499±0.019）、24h（0.747±0.044，0.665±0.026，0.911±0.049）、3d （0.580±0.042，0.483±0.039，0.666±0.037）、7d（0.342±0.021，0.256±0.018，0.378±0.026）均低于TBI组，且差别有统计学意义（P<0.05）。SBI组和SBII组两组间比较，仅于12h、24h、3d差别有统计学意义（P<0.05）。与TBI组相比，SBI组和SBII组p38MAPK表达除1h外，余各时间点均低于TBI组（P<0.05）。SBI组和SBII组组间相比， SBII组与SBI组除1h差异无统计学意义（P>0.05）外，在其余各时间点SBII组p38MAPK表达都低于SBI组（P<0.05）。5Western Blot与TBI组相比，SBI组和SBII组AQP4蛋白表达1h差别无统计学意义（P>0.05），其他时间点差别均有统计学意义（P<0.05），但SBI组与SBII组间组间比较，于12h、24h、3d差别均有统计学意义（P<0.05）。p-p38MAPK表达与AQP4表达一致。p38MAPK表达1h三组间无差异， TBI组与SBI组比较6h差异无统计学意义（P>0.05），但TBI组与SB II组、SBII组与SBI组比较差别有统计学意义（P<0.05），其余各时间点三组间差异均有统计学意义（P<0.05）。6RT-PCR与TBI组相比，SBI组、SBII组AQP41h差异无统计学意义（P>0.05），7d时SBII组与TBI组无差别（P>0.05），其余各时间点三组间比较均有统计学意义（P<0.05）。结论：1大鼠液压冲击脑损伤后， p38MAPK特异性抑制剂SB203580可下调AQP4及其mRNA表达。2SB203580对p38MAPK通路的抑制存在着一定的量-效关系，在一定范围内其用量越大效果越明显。