第一部分 射频消融联合免疫检查点抑制剂治疗肾癌对转移瘤的作用研究目的射频消融在“减瘤”的同时能够调节机体的免疫功能,因而与免疫检查点抑制剂之间存在潜在的协同作用。本实验拟建立小鼠双侧胁腹部皮下肾肿瘤模型,射频消融治疗一侧肿瘤并联合应用PD-1抑制剂,观察两者联合应用对另一侧模拟转移瘤的作用。同时,探究射频消融联合PD-1抑制剂在晚期肾癌中的协同作用机制,为临床应用提供理论基础。材料和方法构建BALB/c小鼠双侧胁腹部皮下肾肿瘤模型,将建模成功的小鼠根据预定方案进行随机分组。小鼠左侧胁腹部肿瘤接种后14日左右,肿瘤体积达到约500 mm~3,对随机分配到射频消融组和联合治疗组的小鼠左侧肿瘤进行射频消融治疗,联合治疗组予以腹腔注射200μg抗PD-1单克隆抗体,每三天注射一次,共三次,动态测量右侧皮下肿瘤的大小,观察小鼠治疗后饮食、活动、体重等情况。采用流式细胞术、酶联免疫吸附试验、酶联免疫斑点试验、蛋白印迹实验等方法检测小鼠外周血、脾脏、肿瘤引流淋巴结及肿瘤细胞内细胞因子等表达情况。选取RFA联合抗PD-1单抗治疗组中观察结束时存活并且“转移瘤”对治疗完全反应的小鼠,进行肿瘤激发试验,观察联合治疗的免疫记忆效应。结果射频消融后两周,切取对侧肿瘤组织,行Western blot分析,结果显示,射频消融能够上调肿瘤细胞PD-L1的表达(P<0.001),射频消融治疗组远隔部位肿瘤的PD-L1水平约为对照组的1.5倍。与对照组相比,序贯治疗和同时治疗均能明显抑制远隔部位肿瘤的生长(P<0.001),序贯治疗组的完全反应率为62.5%(5/8),同时治疗组的完全反应率为50.0%(4/8)。与对照组、手术切除组以及IgG2b组相比,单用PD-1抑制剂虽能在一定程度上抑制肿瘤生长,但是与单独应用射频消融类似,该抑制作用并不明显,肿瘤仍呈持续生长状态,当PD-1抑制剂与射频消融联合应用时,可明显抑制对侧肿瘤的生长(P=0.0023)。射频消融联合PD-1抑制剂依赖于CD8~+T细胞发挥协同抗肿瘤作用。联合治疗可大大增加肿瘤引流淋巴结内成熟树突状细胞的比例。射频消融联合PD-1抑制剂能够明显增加Th1细胞的比例(15.67%±0.81%,P<0.0001),约为对照组的1.5倍,同时降低Th2细胞的比例(1.60%±0.05%,P=0.0001),联合治疗组Th1/Th2的比值较对照组明显增加(9.81±0.34,P<0.0001),约为对照组的两倍。射频消融联合PD-1抑制剂能够在单一PD-1单抗治疗的基础上进一步增加远隔部位肿瘤内IFN-g~+CD8~+TILs和TNF-a~+CD8~+TILs的比例,IFN-g~+CD8~+TILs的比例为3.83%(±0.12%),约为对照组的8倍(P<0.0001),TNF-a~+CD8~+TILs的比例为1.60%(±0.06%),约为对照组的4倍(P<0.0001)。联合治疗不仅能明显增加肿瘤内淋巴细胞的浸润,而且能降低肿瘤浸润调节性T细胞(CD4~+CD25~+Foxp3~+)的比例(3.83%(±0.13%),P<0.0001),CD4效应T细胞、CD8~+T细胞与调节性T细胞的比值分别约为对照组的5倍和4倍(P<0.0001)。肿瘤激发试验结果显示,射频消融联合PD-1抑制剂能够诱导机体产生肿瘤抗原特异性CD8~+T细胞免疫反应,并且存在免疫记忆效应。结论射频消融联合PD-1抑制剂在毁损原发肿瘤病灶的同时,增强全身抗肿瘤免疫反应,进而抑制远隔部位病灶的生长。射频消融能够增加肿瘤细胞表面PD-L1的表达,射频消融联合免疫检查点抑制剂能够促进肿瘤引流淋巴结内树突状细胞成熟,增强机体Th1型免疫反应,增加远隔部位肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞的数目,上调效应T细胞与调节性T细胞的比值,同时诱导机体产生持久的肿瘤特异性抗肿瘤免疫反应。第二部分 射频消融联合免疫检查点抑制剂治疗晚期肾癌并抑制肿瘤转移的机制研究目的通过建立小鼠原位肾肿瘤及肺脏模拟转移瘤模型,观察射频消融治疗肾脏肿瘤并联合不同作用机制的免疫检查点抑制剂对肺脏模拟转移瘤的作用,探究不同的联合治疗策略,寻找最优联合方案,提高联合治疗效果,并降低全身毒副反应。材料和方法:构建BALB/c小鼠原位肾肿瘤及肺脏模拟转移瘤模型,将建模成功的小鼠根据预定方案进行随机分组,小鼠左侧肾肿瘤接种后10日左右,对随机分配到RFA组和联合治疗组的小鼠左侧肾肿瘤进行射频消融治疗。根据预定实验方案,每只小鼠予以腹腔注射200μg抗PD-1单克隆抗体(或200μg抗CTLA-4单抗,或两者联合应用),剂量减半组则注射100μg上述单抗,每三天注射一次,共三次,动态测量体重变化并观察小鼠生存状态。采用称重法及HE染色,评估不同治疗组肺脏的病灶。结果通过肾脏包膜下以及尾静脉注射肾癌Renca细胞,成功构建小鼠原位肾癌及模拟肺转移瘤动物模型。当射频消融联合两种不同作用机制的免疫检查点抑制剂时,可进一步延长小鼠生存时间,该组小鼠生存时间为(40.63±4.34)天,较射频消融联合单一免疫检查点抑制剂组延长约10天(P<0.0001)。通过称量肺脏的重量来评估联合治疗对肺部转移瘤的控制效果,结果显示,射频消融联合双重免疫检查点抑制剂能够明显抑制小鼠肺部肿瘤病灶的形成,该组小鼠肺脏平均重量为(0.24±0.05)克,明显小于其他各治疗组小鼠肺脏的重量(P<0.0001)。射频消融联合低剂量双重免疫检查点抑制剂能够显著延长生存时间,该组小鼠平均生存时间为(39.75±5.01)天,与射频消融联合常规剂量双重免疫检查点抑制剂相比并无显著差异(P=0.714)。同时,射频消融联合低剂量双重免疫检查点抑制剂能够抑制肺脏转移瘤的形成,该组小鼠肺脏平均重量为(0.27±0.05)克,与射频消融联合常规剂量免疫检查点抑制剂相比并无显著差异(P=0.302)。应用较低剂量的双重免疫检查点抑制剂既能有效抑制肿瘤生成,延长生存时间,又能减少不良事件的发生率。结论射频消融联合双重免疫检查点抑制剂可增强机体抗肿瘤免疫反应,抑制肿瘤转移,延长生存时间;射频消融与低剂量双重免疫检查点抑制剂之间仍然具有协同作用,并不降低联合治疗的效果,且理论上讲,该联合策略可降低治疗相关的不良反应。第三部分 生物发光成像监测射频消融联合免疫检查点抑制剂治疗晚期肾癌疗效的研究目的采用Renca-Luc2-GFP细胞建立小鼠原位肾肿瘤及肺脏模拟转移瘤模型,通过生物发光成像监测射频消融联合免疫检查点抑制剂的治疗效果,评估生物发光成像用于早期、实时、动态、非侵入性评价射频消融联合免疫检查点抑制剂疗效的可行性。材料和方法体外扩增稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的小鼠肾癌细胞(Renca-Luc2-GFP),倒置荧光显微镜观察肿瘤细胞绿色荧光的表达情况,生物发光成像检测荧光素酶的活性。通过细胞增殖实验、划痕实验及趋化运动实验等评估肿瘤细胞的增殖、迁移和趋化运动能力。分别采用Renca-Luc2-GFP细胞和Renca细胞构建原位肾肿瘤模型,比较两种细胞在小鼠体内的致瘤性。通过肾脏包膜下注射Renca-Luc2-GFP细胞,构建原位肾脏肿瘤模型,建模后10日行肾肿瘤射频消融,分别进行生物发光成像和磁共振成像评估早期治疗效果。构建上述原位肾脏肿瘤模型,建模后10日从尾静脉注射肿瘤细胞,构建模拟肺转移肿瘤模型,次日行肾肿瘤射频消融,于射频消融后1、4、7日予腹腔注射200mg PD-1单抗,每隔3日行生物发光成像,动态监测射频消融联合PD-1单抗的治疗效果。结果将处于对数生长期的Renca细胞和Renca-Luc2-GFP细胞分别置于倒置显微镜下观察,两者形态学方面无明显差异,对照Renca细胞未见绿色荧光蛋白的表达,而Renca-Luc2-GFP细胞上可见较强的绿色荧光。Renca-Luc2-GFP细胞的生物发光强度与细胞数成正相关(R2=0.9981)。双报告基因转染并不影响肿瘤细胞的增殖、迁移和趋化运动能力。小动物生物发光成像系统可稳定检测到荧光素酶在小鼠体内稳定表达,随着肿瘤的生长,表达荧光素酶的面积逐渐增大,所检测到的荧光光子数也逐渐增多。于建模后第7日,采用小动物7.0T磁共振对原位肾脏肿瘤进行成像,Renca-Luc2-GFP细胞和Renca细胞均能在小鼠肾脏生长,成功构建肿瘤模型,且肿瘤大小无明显差异。单一射频消融后,原肾脏肿瘤区域生物发光强度明显减弱,但一周后可检测到较强的生物发光信号,并随时间推移而增加,且肺部生物发光信号强度也逐渐增强。而射频消融联合PD-1抑制剂治疗后,肾脏和肺部生物发光信号强度增加缓慢,且明显弱于单一射频消融组。上述结果显示,生物发光成像可用于动态监测射频消融联合免疫检查点抑制剂治疗后原发病灶的残留以及远处转移病灶的生长情况。结论采用Renca-Luc2-GFP细胞可成功构建小鼠原位肾癌及模拟肺转移肿瘤模型,为研究肿瘤联合免疫治疗策略提供了新型的工具。生物发光成像能够无创、实时、动态地评估肿瘤治疗过程中原发病灶残留和远处转移病灶的发生、发展情况,可用于动态监测射频消融联合免疫检查点抑制剂治疗晚期肿瘤的效果。