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背景多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)是一组持久性有机污染物和人类致癌物,可经细胞色素P450(CYPs)酶代谢活化,但大部分PCBs化合物的致突变性及其结构-毒性关系尚不清楚。由于致突变是致癌作用的一个重要机制,分析PCBs致突变性对PCBs危险性评估十分重要。依据氯取代基的位置特征,PCBs可分为两大类,一类因具有与二噁英相似的芳烃受体(aromatic hydrocarbon receptor,AhR)配体活性,又称为二噁英样多氯联苯(dioxin-like PCBs,DL-PCBs),另一类则称为非二噁英样多氯联苯(non-dioxin-like-PCBs,NDL-PCBs)。课题组前期发现多个NDL-PCBs由人CYP2E1酶活化,从而具有致突变作用;邻位仅有单个氯的化合物似乎致突变性最强,但尚无系统的结构-毒性关系研究。DL-PCBs对表达人CYP2E1的细胞未呈现致突变作用,但其可否由其他CYP酶活化为致突变物尚不清楚。PCBs可作用于不同核受体而调控CYPs表达水平,其中DL-PCBs通过激活AhR上调CYP1酶,而NDL-PCBs可激活雄烷受体(constitutive androstane receptor,CAR)和孕烷受体(pregnane X receptor,PXR),诱导CYP2B和CYP3A酶的表达。黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是一种依赖CYP1A2和CYP3A4活化的人类致癌物,其与PCBs是否具有联合作用尚无直接证据。目的(1)分析含2～4个氯取代基而邻位氯数目不等的NDL-PCBs对表达人CYP2E1和硫酸基转移酶(SULT)1A1 的重组中国仓鼠V79细胞系(V79-hCYP2E1-hSULT1A1)诱发微核与Hprt突变的作用,探讨PCBs的结构-毒性关系。(2)采用表达人CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1的重组V79细胞及内源性表达CYPs酶的人肝细胞瘤C3A细胞验证DL-PCBs经CYP1酶活化及致突变作用假说。(3)采用人肝细胞(L-02)系探讨NDL-PCBs对核受体、某些CYP酶表达及AFB1遗传毒作用的影响。方法采用 V79-Mz(对照细胞系)、V79-hCYP2E1-hSULT1A1、V79-hCYP1A1、V79-hCYP1A2、V79-hCYP1B1、L-02和C3A细胞系,以CCK-8法检测受试物的细胞毒作用,微核实验和Hprt致突变实验分析受试物遗传毒性,免疫荧光法分析微核的着丝粒蛋白B(centromere protein,CENP-B)(以区分断裂作用与致非整倍体作用),Western blot法分析蛋白表达水平。结果(1)8个三氯联苯与四氯联苯化合物以6 h/18 h(暴露/恢复)方案处理V79-Mz和V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞,结果显示各受试物对后者诱发微核作用强度远大于前者;多数受试物对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞均呈现致突变作用,而对V79-Mz细胞无作用。结合前期报道的其他受试PCBs对上述细胞的致突变作用,发现邻位氯的数目为1时致突变性最强,随着邻位氯数目增加,致突变性降低;变化趋势随化合物氯化程度增高而更明显:二氯联苯受此影响不大,三氯联苯明显受影响,四氯联苯更明显(含3、4个邻位氯者已测不出致突变性)。2,4’,6-三氯联苯(PCB 32)和2,3,3’,4’-四氯联苯(PCB 56)作为代表性化合物对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞诱导的微核中CENP-B阳性者达60%～70%。(2)采用邻位不含氯取代基的DL-PCBs,即3,3’,4,4’-四氯联苯(PCB77)、3,4,4’,5-四氯联苯(PCB 81)和3,3’,4,4’,5-五氯联苯(PCB 126),以不同时程处理V79-Mz、V79-hCYP1A1、V79-hCYP1A2和V79-hCYP1B1细胞,发现在6h/18 h和18 h/6 h方案下,PCB 77和PCB 81对V79-hCYP1B1细胞在μM 水平诱发微核,而对其他细胞系无作用;PCB 126则对上述细胞系均不能诱发微核形成。三个受试物暴露于C3A细胞54 h均诱导CYP1A1和CYP1A2蛋白,对CYP1B1无影响。在54 h/18 h方案下,PCB 77和PCB 81诱发C3A细胞微核并呈浓度相关性,而该效应可被CYP1B1选择性抑制剂tetramethoxystilbene(TMS,30nM)完全抑制。受试物对V79-hCYP1B1和C3A细胞诱发的微核绝大多数为CENP-B阴性。三个受试物暴露于C3A细胞12 h均引起γ-H2AX蛋白水平升高(提示DNA双链断裂),且此效应被TMS(10nM)完全阻断。(3)2,3,3-三氯联苯(PCB 20)、2,2’5,5’-四氯联苯(PCB 52)和PCB 56作为代表性NDL-PCBs暴露于L-02细胞48 h,在μM浓度可提高CAR、PXR、CYP1A1、CYP1A2和CYP3A4蛋白表达而降低AhR蛋白。PCB 126则在亚nM浓度即升高L-02细胞内上述各蛋白表达。在L-02细胞过表达CAR可致CYP1A2和CYP3A4蛋白增高,且增强各NDL-PCB上调CYP1A2和CYP3A4效应。PCB 126和各NDL-PCB处理L-02细胞24 h,均增强AFB1诱发微核及DNA断裂效应,使后者阈浓度由40 μM降至5 μM或10 μM;PCB 126作用强度远高于各NDL-PCB。结论(1)NDL-PCBs基于人CYP2E1活化的致突变作用有如下结构-活性关系特征:邻位氯数目对PCBs的致突变性具有一定影响,单个邻位氯结构者致突变性较强,而邻位氯数目越多则致突变性越低;然而其影响程度因化合物氯化程度不同而异:四氯联苯最明显,三氯联苯次之,二氯联苯受影响最小;其染色体损害以致非整倍体作用为主。(2)DL-PCBs可经人CYP1B1酶活化而呈现致染色体断裂作用。(3)NDL-PCBs和DL-PCBs在影响细胞核受体和某些CYP酶的表达上既有差异,又有复杂的联系;它们均可因诱导CYP1A2和CYP3A4增强AFB1遗传毒作用。总之,PCBs具有特定的结构-活化酶-遗传毒作用关系,又可通过影响真核细胞核受体表达而诱导CYP1A2和CYP3A4酶,从而增强AFB1遗传毒效应。这些作用对PCBs致癌作用的影响值得进一步研究。