近年来,环境污染和食品安全问题层出不穷,已成为大众广泛关注的话题。酶生物传感器(Enzymatic Biosensors,EBS)法与传统检测方法相比具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在线检测等优点,能够弥补传统实验室技术的不足,满足现场操作监测的需求,已在环境监测、食品检验等方面得到高度重视和广泛应用,并成为有机污染物快速检测重要发展趋势。目前,酶生物传感器设计及开发的主要问题在于解决酶蛋白分子固定在载体上的方式及固定化方法。针对传统酶固定化方法中存在的酶活性损失高的缺陷,本研究将乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)作为研究对象,设计开发了一种全新的具有通用性的基于酶蛋白表面结构的定向固定化方法,并且阐明了定向固定化AChE的分子机制及机理,为酶的定向固定化研究开辟了一种全新的思路。具体阐述如下:一、定向固定化AChE设计。以酶蛋白三维晶体结构数据作为研究基础,构建完整的AChE三维分子模型。采用MOLCAD’s multi-channel方法,发现6个AChE蛋白表面潜在固定化位点,并基于蛋白表面结构的疏水性、电性、氢键供体/受体及凹陷结构分布等特征,确定Site1作为AChE定向固定化结合位点。基于Site1和AChE活性中心结构数据,使用分子对接技术对来自ZINC小分子数据库的54159个有机小分子进行虚拟筛选。经过三个步骤的筛查,最终获得共计13个具有不同分子结构功能性固定化小分子配基,依次为儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、(R)-橙皮素、(S)-橙皮素、(R)-柚皮素、(S)-柚皮素、槲皮素、花旗松素、表儿茶素没食子酸酯、氟吡汀、阿托品、莨菪碱。二、功能性固定化小分子配基与AChE相互作用研究。为了验证筛选出的功能性固定化小分子配基与AChE结合能力及结合方式,采用荧光光谱方法,对小分子配基与AChE的相互作用进行研究。结果显示,功能性固定化小分子均能与AChE相互结合,其结合强度由高至低依次为NAR>HES>QUE>>EPG,TAX>CAT,EPI,FLU>GLI>>ATR,HYO。同时,酶活性测定实验确认了所有功能性固定化小分子配基与AChE的结合不会影响酶的催化活性。三、AChE定向固定化酶制备、表征及稳定性研究。选用NAR、CAT、GLL三种功能性固定化小分子配基,以氨基磁性纳米颗粒为基础载体,设计、制备、表征三种定向固定化AChE,并采用酶活性测试方法对定向固定化AChE的pH稳定性、温度稳定性、重复使用性进行全面的考察。结果显示,与游离态酶和传统方法固定化酶相比,定向固定化AChE在多项性能上均有明显提升,尤其是在酶活性保留(均大于90%)和固定化稳定性方面提升显著(pH稳定性最大提升约70%,温度稳定性最大提升约130%)。此研究不但获得了定向固定化AChE的稳定性实验数据,同时也验证了本文设计开发的定向固定化方法的正确性。四、定向固定化AChE机理研究。为了全面阐明定向固定化AChE机制,明确影响定向固定AChE稳定性的要素,本研究采用多种分子模拟手段(分子动力学、加速分子动力学),对定向固定化过程中功能性固定化小分子配基与AChE的结合方式、结合稳定性及结合过程中构象的变化进行深入的研究,通过大量多次的分子动力学-加速分子动力学模拟、轨迹分析、构象对比,揭示出AChE酶蛋白与功能性固定化小分子配基相互作用、相互影响的动态过程,并确认了功能性固定化小分子配基与AChE定向固定结合时,不但不会影响酶蛋白分子的正常结构及催化功能,而且对酶蛋白结构具有潜在的稳定性提升能力。最终,定向固定化AChE的分子作用机制及机理得以全面的阐释。