研究目的:chemerin是一个脂肪和炎症因子,与肥胖及肥胖相关疾病的发生、疾病的严重程度以及糖代谢紊乱密切相关。运动降低患肥胖、糖尿病的人或动物的血清chemerin和组织chemerin水平,同时糖脂代谢得以改善,但运动降低chemerin水平后,通过什么机制来改善紊乱的糖脂代谢目前还不清楚。我们前期的研究发现,有氧运动改善糖尿病大鼠糖脂代谢的作用可能与运动降低chemerin水平有关,减少的chemerin可能是通过上调过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)-糖脂代谢关键酶(如脂肪甘油三酯水解酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)和脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)等途径来实现改善糖脂代谢的作用。本文在前期研究的基础上,利用外源补充chemerin来证实减少的chemerin在有氧运动改善糖尿病小鼠糖脂代谢中的作用及其机制—是否与PPARγ调控的糖脂代谢酶或蛋白[ATGL、LPL、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和葡萄糖转运子4(Glucose transporter 4,GLUT4)]有关?机体chemerin的来源主要是脂肪组织和肝的分泌。脂肪是一个内分泌器官,在调节全身代谢平衡以及脂肪因子的分泌中起着关键作用,且chemerin及其受体CMKLR1在脂肪组织中高表达。因此,本研究构建了脂肪特异性chemerin敲除小鼠,研究其与野生型小鼠比较,在普通和高脂喂养时糖脂代谢紊乱和肥胖发生的难易和严重程度,以明确chemerin在糖脂代谢中的作用。进一步研究脂肪chemerin敲除对血清chemerin、其他外周代谢器官(肝和骨骼肌)的糖脂代谢酶及其上游分子PPARg是否有影响,以证实chemerin在调控糖脂代谢中的作用及机制。在此基础上,研究6周有氧运动对高脂喂养的脂肪特异性chemerin敲除小鼠体脂和糖脂代谢的影响,以探讨有氧运动的作用是否与PPARγ和糖脂代谢酶(ATGL、LPL和GLUT4等)有关。研究方法:第一部分实验:外源补充chemerin逆转运动对糖尿病小鼠糖脂代谢的改善作用及机制。6周龄的雄性ICR小鼠70只,随机分为正常对照组(n=24)和2型糖尿病造模组(n=46)。采用6周高脂饲料喂养合并空腹腹腔注射STZ(链脲佐菌素,streptozotocin)(100 mg/kg)方法建立糖尿病小鼠模型。正常对照组随机分为正常组(Con,n=8)、正常运动组(E,n=8)和正常+外源性chemerin组(C,n=8)。建模成功的糖尿病模型小鼠随机分为糖尿病对照组(DM,n=8)、糖尿病运动组(EDM,n=9)和糖尿病运动+外源性chemerin组(EDC,n=10)。运动组小鼠进行为期6周的递增负荷中等强度跑台运动,每周6天,每天1次。外源性补充chemerin(剂量为8 ng/g,采用腹腔注射)小鼠在运动后3周开始补充chemerin。检测小鼠的体成分、血脂四项、FBG水平,ELISA检测血清chemerin和空腹胰岛素(FINS)水平,并根据FBG和FINS计算胰岛素抵抗(HOMA-IR)。用Western Blot方法分别检测小鼠肝、腓肠肌和附睾脂肪chemerin、CMKLR1、PPARγ、ATGL、LPL、GLUT4和PEPCK的蛋白水平。第二部分实验:脂肪特异性chemerin敲除小鼠在普通和高脂喂养时的肥胖发生率和糖脂代谢紊乱及机制1.脂肪chemerin敲除(fabp4-cre)小鼠普通和高脂喂养时的肥胖发生率和糖脂代谢动物分组:8周龄的小鼠分为野生对照C57小鼠(WT)组、flox对照组(flox/flox)、脂肪chemerin敲除杂合子组[chemerin(+/-)]和脂肪chemerin敲除纯合子组[chemerin(-/-)](此部分敲除小鼠采用的cre工具鼠是fabp4-cre),雌雄各半,共4组,每组6只,给予11周普通饲料喂养。此外,另有上述相同的4组小鼠给予11周高脂饲料喂养,每组6只。检测指标和方法均与第一部分相同。2.另一种脂肪特异性chemerin敲除小鼠(adiponectin-cre)高脂喂养时的体脂和糖脂代谢改变fabp4-cre和adiponectin-cre都是脂肪特异性敲除靶基因的工具鼠,但两种工具鼠的特异性存在争议。fabp4-cre工具鼠敲除白色脂肪和棕色脂肪的靶基因,而adiponectin-cre工具鼠只敲除白色脂肪的靶基因。因此又构建了adiponectin-cre敲除小鼠。动物分组:8周龄的小鼠随机分为WT组、flox/flox组、(-/-)·fabp4组、(-/-)·adiponectin组,雌雄各半,共4组,每组6只。全部高脂喂养11周。检测指标和检测方法同上。第三部分实验:有氧运动对高脂喂养的脂肪特异性chemerin敲除小鼠糖脂代谢的影响及机制动物分组:8周龄小鼠分为WT组、flox/flox组、(-/-)·fabp4组、(-/-)·adiponectin组,雌雄各半,每组12只。5周高脂喂养后,这4组小鼠分别再随机分为高脂对照组和高脂+运动组,雌雄各半,总共8组,每组6只。运动组小鼠进行为期6周的递增负荷中等强度跑台运动,每周6天,每天1次。检测指标和检测方法同上。研究结果:1.外源补充chemerin逆转运动对糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱的改善作用及机制(1)外源补充chemerin可逆转6周有氧运动对糖尿病小鼠糖脂代谢、脂肪肝和肝重量的改善作用。(2)外源补充chemerin可减弱6周有氧运动对糖尿病小鼠chemerin(血清、肝、腓肠肌和脂肪)和CMKLR1(肝、腓肠肌和脂肪)蛋白水平的降低作用。(3)外源补充chemerin可降低6周有氧运动对糖尿病小鼠肝、腓肠肌和脂肪PPARγ、ATGL、LPL和GLUT4蛋白水平的增加作用,但对肝PEPCK蛋白水平无显著影响。2.脂肪特异性chemerin敲除小鼠在普通和高脂喂养时的肥胖发生率和糖脂代谢紊乱及机制2.1脂肪特异性chemerin敲除(fabp4-cre)小鼠在普通和高脂喂养时的肥胖发生率和糖脂代谢紊乱(1)肥胖发生率:普通膳食时,与野生型或flox对照小鼠相比,脂肪chemerin敲除小鼠的肥胖发生率无差异(未见肥胖小鼠)。但高脂膳食时,脂肪chemerin敲除小鼠的肥胖发生率,雌性增加、雄性降低。(2)糖脂代谢和脂肪肝情况:普通膳食下,与WT或flox对照组小鼠相比,脂肪chemerin敲除小鼠的体脂含量、糖脂代谢无显著差异,且都在正常值范围。但高脂膳食下,与WT或flox对照小鼠相比,脂肪chemerin敲除小鼠出现胰岛素敏感性降低、脂代谢紊乱(血清TC、LDL和TG升高)以及肝重量增加和脂肪肝。此外,chemerin敲除小鼠在高脂膳食下的上述改变存在性别差异,表现为雌性更易胖,但未出现脂肪肝;而雄性不易胖,但出现了脂肪肝。2.2脂肪特异性chemerin敲除(fabp4-cre)小鼠普通和高脂喂养时chemerin、CMKLR1、PPARg和糖脂代谢酶的蛋白水平普通膳食下,脂肪chemerin敲除小鼠与WT小鼠相比:(1)血清chemerin水平显著降低;(2)肝chemerin、CMKLR1、PPARγ(但雄性增加)、LPL(但雄性增加)和PEPCK的蛋白水平无显著变化,ATGL蛋白水平增加;(3)腓肠肌的chemerin和CMKLR1蛋白水平显著增加,PPARγ、ATGL和LPL的蛋白水平显著降低。高脂膳食下,脂肪chemerin敲除小鼠与WT小鼠相比:(1)腓肠肌、肝的chemerin和CMKLR1的蛋白水平均显著增加,这可能是脂肪chemerin敲除小鼠在高脂膳食下血清chemerin与高脂喂养WT小鼠相比无变化的原因(因为除脂肪外,肝也是血清chemerin的来源,高脂喂养增加了肝chemerin分泌)。(2)与WT小鼠相比,雄性chemerin敲除小鼠肝和腓肠肌PPARγ、ATGL和LPL蛋白水平降低、肝PEPCK增加,仅腓肠肌GLUT4增加,这可能是雄性chemerin敲除小鼠脂代谢异常更严重、且有脂肪肝的原因。对于雌性chemerin敲除小鼠,肝LPL和PEPCK增加、ATGL降低,腓肠肌ATGL和LPL降低、PPARγ和GLUT4增加。2.3高脂喂养的另一种脂肪特异性chemerin敲除小鼠(adiponectin-cre)的肥胖率、体脂、糖脂代谢和chemerin等靶分子水平,及其与chemerin(-/-)·fabp4的比较(1)肥胖发生率:高脂喂养的chemerin(-/-)·adiponectin小鼠的肥胖率,与WT小鼠相比,雄性降低(67%vs 100%)、雌性增加(67%vs 50%)。这个特点也出现在chemerin(-/-)·fabp4小鼠(雄性:80%vs 100%;雌性:100%vs 50%)。(2)糖脂代谢和脂肪肝:高脂喂养的chemerin(-/-)·adiponectin小鼠,雄性的胰岛素敏感性增强,没有脂代谢紊乱和脂肪肝,且血清TC和TG水平还低于野生对照小鼠;雌性的糖耐量增强、胰岛素敏感性不变,但血清LDL升高。而chemerin(-/-)·fabp4小鼠,雄性出现胰岛素敏感性降低、脂代谢紊乱(血清TC、LDL升高)、肝重量增加和脂肪肝;雌性则糖耐量增强、胰岛素敏感性降低和脂代谢紊乱(血清TC、LDL升高)。(3)chemerin等各靶分子的蛋白水平:高脂喂养的chemerin(-/-)·adiponectin小鼠与野生型的相比:(1)血清:雌雄均出现血清chemerin显著降低。(2)肝:雄性的chemerin无变化、CMKLR1增加,PPARγ无变化、ATGL和LPL均增加;雌性的chemerin增加(低于(-/-)·fabp4小鼠)、CMKLR1无变化,PPARγ、ATGL和LPL均增加。(3)腓肠肌:雄性chemerin和CMKLR1增加、PPARγ、ATGL无变化、LPL降低、GLUT4增加(但chemerin和CMKLR1低于(-/-)·fabp4小鼠,PPARγ、LPL和GLUT4高于(-/-)·fabp4小鼠);而雌性的chemerin和CMKLR1增加,PPARγ不变、GLUT4增加、LPL降低。而高脂喂养的chemerin(-/-)·fabp4小鼠与野生型的相比:(1)血清:雌雄小鼠的血清chemerin水平与野生型相比没有变化。(2)肝:雌雄的肝chemerin和CMKLR1蛋白水平均升高,但雄性PPARγ、ATGL和LPL蛋白水平降低,而雌性PPARγ无变化、LPL和PEPCK增加、ATGL降低;(3)腓肠肌:雌雄的腓肠肌chemerin和CMKLR1增加,但雄性PPARγ、ATGL、LPL降低、GLUT4增加,而雌性PPARγ增加、ATGL和LPL降低、GLUT4增加。3.有氧运动对高脂喂养的脂肪chemerin敲除小鼠糖脂代谢的影响及机制(1)运动对chemerin敲除小鼠体脂含量的影响:6周有氧运动降低这两种脂肪chemerin敲除的雄性小鼠体脂含量,但对雌性敲除小鼠无影响。(2)运动对chemerin敲除小鼠糖脂代谢的影响:6周有氧运动改善雄性脂肪chemerin敲除小鼠的糖脂代谢及减轻脂肪肝[仅(-/-)·fabp4小鼠有脂肪肝]。运动也能改善雌性脂肪chemerin敲除小鼠的糖脂代谢(降低血清胰岛素和HOMA-IR水平,降低血脂)。(3)运动降低chemerin敲除小鼠的血清chemerin水平:尽管高脂膳食下,(-/-)·adiponectin小鼠血清chemerin水平降低、而(-/-)·fabp4小鼠的不变,但6周有氧运动可降低这两种脂肪chemerin敲除小鼠的血清chemerin水平。(4)运动对chemerin敲除小鼠糖脂代谢相关蛋白的影响:6周有氧运动对这两种脂肪chemerin敲除的雌雄小鼠糖脂代谢相关蛋白均有改善作用,表现为增加雌雄chemerin(-/-)·adiponectin小鼠的腓肠肌PPARγ(仅在雄性)-糖脂代谢酶(ATGL、LPL和GLUT4)水平,以及上调雌雄的chemerin(-/-)·fabp4小鼠肝PPARγ和糖脂代谢酶ATGL、LPL(雌性仅增加ATGL)水平。结论:1.证实了减少的chemerin在6周有氧运动改善糖尿病小鼠糖脂代谢中的重要作用,且该作用是通过chemerin受体(CMKLR1)的介导来上调PPARγ-糖脂代谢酶(ATGL、LPL和GLUT4)实现的。2.脂肪特异性chemerin敲除[(-/-)·adiponectin]小鼠喂以高脂膳食后体脂和糖脂代谢的变化存在性别差异(表现为雄性小鼠不易胖、胰岛素敏感性增强和血脂降低,而雌性小鼠易胖、血脂LDL升高);性别差异的原因很可能是由于雌雄chemerin敲除小鼠肝和骨骼肌chemerin和PPARγ-糖脂代谢酶(如ATGL和LPL等)水平不同所致。3.无论雌雄,脂肪chemerin敲除[(-/-)·adiponectin]小鼠都比脂肪chemerin[(-/-)·fabp4]小鼠的糖脂代谢要好(后者的雄性小鼠尽管仍然不易胖,但出现血脂异常和脂肪肝);其机制可能也是与chemerin(-/-)·adiponectin小鼠的肝或腓肠肌PPARγ-糖脂代谢酶更高以及血清chemerin更低有关。4.6周有氧运动对高脂喂养的这2种脂肪chemerin敲除小鼠,仅降低雄性的体脂含量(对雌性无影响),但改善雌雄小鼠的血糖血脂水平、改善程度雄性更佳;其作用机制可能还是与运动降低血清chemerin以及增加肝或腓肠肌PPARγ-糖脂代谢酶的程度不同(雄性的上述指标改变更明显)有关。简言之,本文利用外源chemerin和chemerin敲除小鼠证实了chemerin在高脂喂养所致糖脂代谢异常中的作用,以及减少的chemerin在运动改善糖脂代谢中的作用;且chemerin的上述作用都是通过调控PPARγ-糖脂代谢酶(ATGL、LPL和GLUT4)水平实现的。