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乳腺发育状况是决定乳产量的重要因素之一。适当的能量供应对乳腺发育至关重要,营养匮乏或营养过剩都将影响乳腺的正常发育。目前尚缺乏对乳腺发育、泌乳及退化各个时期能量代谢的全面研究和乳腺能量代谢调控的基础研究。本研究以奶山羊为实验材料,检测乳腺组织发育各时期能量代谢相关途径关键酶的活性。结果表明:己糖激酶(hexokinase,HK)、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,ICDH)和ATP酶在妊娠期活性升高,泌乳期活性保持在较高的水平,泌乳35日达到最大值,乳腺退化后活性降低,HK、ICDH和ATP酶在妊娠期和泌乳期活性升高,表明乳腺组织中能量代谢上调;肉碱棕榈酰转移酶(Carnitine palmitoyltransferase,CPT)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6 - phosphogluconate dehydrogenase,G6PDH)活性在泌乳期活性升高,泌乳35日达到最大值,乳腺退化后活性降低,在泌乳期CPT活性升高,表明乳腺利用脂肪酸氧化供能。本研究采用高效液相色谱检测奶山羊乳腺发育各时期乳腺中腺苷酸含量及能荷。结果表明:妊娠期腺苷酸含量增加,泌乳启动后腺苷酸含量急剧升高,泌乳期保持较高的水平,泌乳35日含量达到最大值,乳腺退化后含量下降。除泌乳35日以外,乳腺发育各时期能荷维持在0.5~0.9之间,泌乳35日的能荷值为0.3。本研究采用荧光定量PCR、Western blotting和激光扫描共聚焦显微技术首次对奶山羊乳腺发育、泌乳及退化各个时期乳腺中葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter-1,GLUT1)mRNA水平和蛋白水平表达及GLUT1蛋白定位进行系统研究。结果表明:在乳腺发育各时期GLUT1mRNA水平和蛋白水平表达趋势相似,呈显著正相关。青春期,乳腺中GLUT1 mRNA和蛋白的表达较低;妊娠期开始升高,妊娠35日乳腺中GLUT1 mRNA和蛋白表达最高,并在整个泌乳期维持在高水平;幼仔离乳后,乳腺上皮细胞凋亡,GLUT1 mRNA和蛋白表达下降。青春期和妊娠早期,GLUT1主要在乳腺导管上皮细胞被检测到;妊娠晚期和泌乳期,GLUT1存在于腺泡上皮细胞靠近基底侧和细胞外基质中;退化期,GLUT1在腺泡上皮细胞中被检测到。这些结果表明在乳腺发育的各个时期,乳腺通过GLUT1吸收葡萄糖为乳腺的发育和和泌乳提供能量。为了探讨乳腺能量代谢调控机制,(1)采用荧光定量PCR技术检测调控能量代谢蛋白激酶AKT及其下游作用物HKⅡ和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)基因在奶山羊乳腺发育各时期的表达。结果显示:在泌乳期AKT、HKⅡ和LDH基因高表达,泌乳35日表达最高。AKT激活后可通过促进糖酵解和氧化磷酸化提高细胞内ATP水平。泌乳期AKT、HKⅡ和LDH基因高表达提示AKT对乳腺能量代谢调控。(2)采用荧光定量PCR技术检测调控能量代谢的AMP依赖性蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路基因LKB1、AMPKα2和AMPKβ1在奶山羊乳腺发育各时期的表达。结果显示:LKB1、AMPKα2和AMPKβ1在泌乳1日、泌乳35日和泌乳60日高表达,与其他时期差异均显著。乳腺在分娩后启动泌乳,此时能量需求激增,泌乳35日和泌乳60日乳腺处于泌乳高峰期,需要大量ATP来合成乳汁,AMPK信号通路基因在这两个时期高表达提示AMPK可能参与乳腺细胞能量代谢调控。为了研究AMPK对乳腺细胞代谢的影响,在乳腺细胞培养液中添加AMPK激活剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-amino-4-imidazolecarboxamide-riboside,AICAR),培养15min、30min和60min后检测AMPK激活后对乳腺细胞糖代谢、脂代谢和蛋白质合成的影响。结果显示:培养15min、30min和60min的激活组和对照组AMPK活性差异显著(p<0.05),培养液中添加AICAR提高AMPK活性。激活组与对照组相比葡萄糖吸收显著增多(p<0.01),GLUT1 mRNA表达升高(p<0.05),糖原合成酶(glycogen synthase-1,GYS1)mRNA表达下降(p<0.05);激活组与对照组相比CPT1mRNA表达升高(p<0.05),脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coa carboxylase-1,ACC1)mRNA表达下降(p<0.05);激活组与对照组相比核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinases,S6K1)表达下降(p<0.05),真核细胞启动子4E结合蛋白(4E-BP1)表达与对照组差异不显著(p>0.05)。结果表明乳腺细胞中AMPK激活后分解代谢增强,合成代谢下降。