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菊花是菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序。许多研究表明,菊花有着多方面的生物活性,例如,抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌和心血管的保护作用。根据生长地区和加工过程的不同,菊花可以分为亳菊(安徽亳州)、滁菊(安徽滁州)、贡菊(安徽黄山)、杭白菊(浙江桐乡)和怀菊(河南焦作)五个主要品种。实际上,这五种菊花在药用和茶饮中都没有很明显的区分,他们在药典里都被归为“菊花”。当前,只有绿原酸、木犀草苷和异绿原酸A被药典规定为含量检测的成分,至今仍没有关于与生物活性关联的区分几个菊花品种的全面报道。而这会对菊花的质量和安全性产生严重的影响。更严重的是,现在中药材市场上菊花的质量差异很大,仍然存在着大量的不合格产品。所以,很有必要建立一个能快速有效的检测菊花质量的方法体系。 在本实验中,我们首先在体内和体外对菊花的抗炎效果进行了评价。建立了铜绿假单胞菌感染的小鼠肺部急性感染模型,结果表明,菊花给药后能显著提高小鼠的存活率,降低TNF-α、IL-6和IL-8等炎症因子的表达,减少肺部细胞因子及免疫细胞的浸润,改善肺部组织的水肿、坏死脱落。另外,建立了肿瘤坏死因子-α刺激人肾上皮细胞产生的炎症模型,利用双荧光素酶报告基因系统对50批菊花给药后NF-κB的表达进行检测,结果发现,在亳菊、滁菊、贡菊、杭白菊和怀菊中分别有5,4,6,7,6个批次有抗炎活性,说明市场上售卖的菊花样品并不是都有着很好的生物活性,其质量参差不齐。 对50批菊花样品进行了UPLC-Q/TOF MS分析,然后利用主成分分析和偏最小二乘法分析,对50批样品的质谱数据进行分析,由得分图可知,5种菊花样品有着很明显的分离趋势,分离度较大,从载荷图中分析得到了19个对分类贡献最大的标记物。 实验采用了热图分析的方法对19个标记物在50个菊花样品中的相对含量进行了分析。另外,利用人工神经网络(ANN)分析方法,对19个标记物和50个样品的生物活性间的关系进行了分析。分析热图结果,发现19个标记物在50个样品中的含量分布没有明显的规律性,而通过ANN分析后,得到6个含量与生物活性成正相关的单体,分别为绿原酸、芹菜素-7-O-新陈皮糖苷、异绿原酸A、雏菊叶龙胆酮、木犀草素、芹菜素-7-O-半乳糖苷和去甲当药苷,其中绿原酸和木犀草素的含量变化与生物活性变化成完全的正相关关系。因此,这两个单体是我们后续研究的重点对象。 实验建立了一种简便、快速的UPLC/Q-TOF-MS结合双荧光素酶报告基因系统的筛选NF-κB抑制剂的分析方法,对菊花样品中的抗炎成分进行筛选鉴定,共筛选出3种结构类型的NF-κB抑制剂,分别为:咖啡酰基奎宁酸类(绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸B),黄酮类(木犀草素、木犀草素-7-O-芸香糖苷,木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-6"-丙二酰基葡萄糖苷、芹菜素-7-O-芸香糖苷和芹菜素-7-O-葡萄糖苷)和黄酮醇类(槲皮素-7-O-半乳糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷)。 按照药典规定的检测方法,对绿原酸、木犀草苷、异绿原酸A和木犀草素在50批菊花样品中的含量进行了高效液相色谱法定量分析。有17批样品不合格,与前面的活性检测结果大体一致。另外,利用四个单体的定量数据对有活性和无活性样品进行了PLS-DA分析,结果发现,利用四个单体的定量数据聚类的结果比只利用药典里规定的三个单体的聚类结果要好的多,有活性组和无活性组能明显的区分开。所以,我们建议将木犀草素也作为菊花质检的一个重要指标。 总之,本实验建立了一个串联的整合了超高效液相色谱质谱串联仪、主成分分析、热图分析和人工神经网络分析结合NF-κB双荧光素酶报告基因系统的分析方法用来筛选不同菊花样品中的生物活性成分。这个快速且系统的方法对菊花药材质控的标准化有着非常大的作用。而且,这个高效的方法或许会成为建立其他中药材甚至食品的关联活性的质控的一个强有力的方法工具。