论文部分内容阅读
漆酶(Laccase, EC1.10.3.2)是一种含铜离子的多酚氧化酶,在木质素降解过程中发挥重要作用,是食用菌碳源和能源代谢中的关键酶,对食用菌产量和品质具有直接影响。本文在筛选黑木耳漆酶高产菌株的基础上,对发酵条件、分离纯化及酶学性质进行研究,主要研究结果如下：1.将25种黑木耳菌种接种于愈创木酚平板,通过记录变色圈直径,选择产漆酶快,产量高的三个菌种：LY,方正,JGDQ。将菌种接种于摇瓶培养并比较其酶学性质,菌株LY温度稳定性和pH稳定性均优于其他两种菌株：摇瓶发酵9d,LY漆酶活力为115U/L,最适反应温度为45℃。55℃时,LY漆酶的半衰期在50min以上,最适反应pH为4.0。pH为5.5,25℃保温4h时,仍能保持50%的相对酶活。pH为6.5时,LY保温4h时稳定性良好,pH为7.5,LY的半衰期为2h。故确定LY为漆酶高产菌株。2.向野生黑木耳产酶培养基中添加不同种类的碳源,氮源,金属离子,控制发酵过程中的pH值,装液量,发酵温度和接种量,通过测量酶活(ABTS法)、菌丝干重、利用单因素实验和均匀设计实验进一步优化产酶培养基的组分。结果表明,摇瓶产漆酶最佳的培养基组分为：玉米粉23.5g/L,葡萄糖23.Sg/L,氯化铵1.Sg/L,豆饼粉3g/L, KH2PO42.9g/L, MgSO41.8g/L, CuSO4·5H2O0.009g/L,水1L,通过DPS软件计算,预测酶活值可达67U/L。经过产酶条件二步寻优,摇瓶产漆酶最佳的培养基组分为：玉米粉28.1g/L,葡萄糖28.1g/L,氯化铵4.7g/L,豆饼粉9.3g/L, KH2PO43.7g/L, MgSO40.9g/L, CuSO4·5H2O0.006g/L。最佳环境条件为：pH6.5,装液量50mL/250mL,发酵温度28℃,接种量4%(v/v),通过DPS软件计算,预测酶活值可达98U/L。3.对野生黑木耳LY的粗酶液进行Native-PAGE电泳后发现含有三种漆酶同工酶(LacA, LacB, LacC)。采用硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sepharose fast flow阴离子柱层析纯化,得到电泳纯的LacB,纯化倍数4.53,酶回收率47.93%。LacB经SDS-PAGE检测为一条带,其表观分子量为64.7KD。 LacB催化底物ABTS氧化的最适温度为45℃,最适pH值为4.0,Km值为0.02mmol/L。LacB在25-55℃(pH4.0)和pH2.5-6.5(30℃)下稳定。Cu12+、K+和Mg+对酶活力有促进作用,Mg2+最为明显。Fe2+、Zn2+和Mn2+对酶活力有抑制作用,其中Fe+最为明显。LacB可以使合成染料结晶紫明显脱色,不添加ABTS的情况下,24h脱色率为89.8%。