三碘甲腺原氨酸对氧化应激RIN-m5F细胞的保护作用及机制探究

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目的:氧化应激被认为是胰岛β细胞功能障碍及胰岛素分泌降低的重要因素,胰岛β细胞氧化损伤与代谢综合征的发生发展密切相关。3,5,3’-三碘甲状腺原氨酸(T3)是甲状腺激素的主要活性形式,可通过调节相关基因转录以及蛋白合成调控细胞生长、分化和代谢。研究发现,代谢综合征人群常伴有亚临床甲减(游离T3水平低)症状,补充一定剂量T3可提高胰岛素分泌水平,但其作用机制尚不明确。本研究拟建立高糖(G)和H2O2氧化损伤RIN-m5F细胞模型,以探究T3对胰岛β细胞氧化还原状态、细胞凋亡及胰岛素分泌的调节作用及其可能机制,为预防和治疗代谢综合征提供理论依据。方法:11mM、22mM、44mM G分别孵育RIN-m5F细胞48h,以及10μM、50μM、100μM H2O2孵育1h建立体外氧化损伤细胞模型。实验分组如下:对照组(CON)、氧化损伤组(G/H2O2)、硫辛酸阳性对照组(LA+G/H2O2)、T3组(T3+G/H2O2)。DCFH-DA荧光探针法检测胞内ROS水平;MTT法检测细胞存活率;试剂盒检测氧化还原状态相关指标;流式细胞术检测线粒体膜电位;ELSIA检测胰岛素自分泌水平(GSIS);RT-PCR检测细胞GSK-3β/Nrf2信号通路关键基因、凋亡基因及胰岛素合成分泌相关基因mRNA表达水平;Western-blot检测p-Tyr216GSK-3β、p-Ser9GSK-3β磷酸化水平及Nrf2核质蛋白水平。结果:随着G和H2O2浓度的增加,胞内ROS和MDA水平显著提高(P<0.05),细胞均出现不同程度的氧化损伤;添加10-7M-10-5M T3可显著降低ROS水平、MDA含量(P<0.05),显著升高细胞存活率、抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性(P<0.05);T3影响Nrf2通路相关基因表达,可显著下调GSK-3β及Keap-1mRNA表达水平,上调PI3K、AKT、Nrf2及下游抗氧化酶(HO-1、NQO-1、MnSOD、CAT)mRNA表达水平(P<0.05);此外,T3显著提高线粒体膜电位、上调抗凋亡因子BCL-2mRNA表达水平以及胰岛素合成分泌相关基因PDX1、MafA、INS2、Glut2、ATPase mRNA表达水平,下调凋亡因子BAX基因表达及UCP2mRNA表达水平,进而提高细胞胰岛素自分泌能力(P<0.05)。Western blot结果显示,T3显著增加p-Ser9GSK-3β磷酸化水平及Nrf2核质比例、降低p-Tyr216GSK-3β磷酸化水平,提高细胞抗氧化能力。结论:添加一定剂量T3可显著增强氧化损伤(G和H2O2)RIN-m5F细胞抗氧化酶活性及GSK-3β/Nrf2通路相关基因mRNA表达水平,降低胞内ROS和MDA水平;T3可上调抗凋亡基因BCL-2、下调促凋亡基因BAX mRNA表达,增强细胞线粒体膜电位,对抗细胞凋亡;T3促进胰岛素合成与分泌相关因子mRNA表达水平,提高细胞胰岛素合成与分泌水平;T3抗氧化及抗凋亡作用机制可能与提高p-GSK-3β (Ser9)磷酸化水平和Nrf2核质比例,降低GSK-3βTyr216磷酸化水平有关,且其调节作用具有浓度依赖效应,即随着氧化损伤程度的增加,T3需要量增加。
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