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研究背景:急性肝功能衰竭(acute liver failure,ALF)是由多因素所引发的迅速和严重的肝损伤,临床上如何治疗ALF一直是难以解决的问题。现阶段治疗ALF最有效的方法是肝脏移植,但其受到供体短缺和手术费用高昂等因素的限制,无法常规应用。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植作为一种新兴细胞移植疗法,成为了治疗ALF的研究热点,然而,研究表明移植的MSCs仅有少量细胞募集到受损组织,其治疗效果受到移植后的低细胞利用率和存活率的限制。胶原凝胶具有良好的生物相容性和特有的拓扑三维结构,既可以为细胞的靶向递送提供载体,同时也可以提供细胞生长所需的三维环境,进而维持并提高MSCs的存活能力与功能。然而,目前移植胶原凝胶复合MSCs是否对ALF具有更好的治疗效果缺乏研究。本研究建立以D-氨基半乳糖苷(D-Galactosamine,D-Gal)诱导的小鼠ALF模型,通过检测胶原凝胶复合MSCs移植在治疗小鼠ALF中取得的疗效,为胶原凝胶复合MSCs移植应用于临床治疗ALF提供实验基础和依据。研究目的:本研究主要探讨移植胶原凝胶复合MSCs对ALF小鼠的治疗作用及相关作用机制。研究方法:分离C57BL/6小鼠的骨髓MSCs,体外贴壁培养,每3天换液,用传至3-6代的MSCs进行实验。将MSCs与胶原凝胶混合制备,通过扫描电子显微镜检测胶原凝胶与MSCs的生物相容性。将经荧光预处理的MSCs、胶原凝胶复合MSCs分别肝脏多点注入ALF小鼠的肝脏,进行小动物活体成像检测,探究MSCs在肝脏中定植情况。将105只C57BL/6小鼠随机分为5组:(1)对照组(生理盐水);(2)D-Gal+PBS组;(3)D-Gal+胶原凝胶组;(4)D-Gal+MSCs组;(5)D-Gal+胶原凝胶-MSCs组。组(1)中的小鼠腹腔注射生理盐水,另外4组小鼠腹腔注射D-Gal,建立小鼠ALF模型。于造模12小时后,4组ALF小鼠分别肝脏多点注射200μLPBS、200μL胶原凝胶、1×10~6MSCs、包含1×10~6MSCs的胶原凝胶-MSCs,统计各组小鼠的生存率。检测各组小鼠的ALT、AST和炎症因子水平,Western bloting、组织病理学染色检测各组小鼠肝脏组织中肝细胞的增殖和凋亡水平。结果:扫描电镜发现胶原凝胶与MSCs具有较好的相容性,小动物活体成像检测发现几乎所有信号均集中于肝脏,脾脏位置无信号,胶原凝胶复合MSCs移植的信号强于单独MSCs移植的ALF小鼠。经D-Gal处理后,小鼠血清中AST和ALT水平显著增高,并且在给药后第3天达到峰值。肝功能指标在D-Gal+胶原凝胶-MSCs组和D-Gal+MSCs组的小鼠明显优于D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组(P<0.05),D-Gal+胶原凝胶-MSCs组比较D-Gal+MSCs组有明显改善(P<0.05)。HE染色提示D-Gal+胶原凝胶-MSCs组和D-Gal+MSCs组的肝脏损伤程度轻于D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组,D-Gal+胶原凝胶-MSCs组轻于D-Gal+MSCs组。D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组小鼠3天生存率不足15%,两组之间无显著差异,MSCs治疗组小鼠7天生存率为44%,而胶原凝胶复合MSCs治疗组小鼠生存率相比较单纯MSCs治疗组显著提高(7天生存率76%)。Western Bloting和免疫组化均显示D-Gal+胶原凝胶-MSCs组肝细胞增殖率明显优于D-Gal+MSCs组、D-Gal+PBS组及D-Gal+胶原凝胶组,同时,肝细胞凋亡明显低于D-Gal+MSCs组,相应的肝脏内IL-1β、IL-6、TNF-α、i NOS和CCL2等炎性因子水平D-Gal+胶原凝胶-MSCs也低于D-Gal+MSCs组。进一步的研究发现,D-Gal+胶原凝胶-MSCs通过激活PI3K/AKT信号通路发挥治疗作用。实验表明,尽管胶原凝胶本身对ALF无治疗作用,但胶原凝胶复合MSCs移植能增强MSCs的肝脏定植能力,并能对小鼠ALF产生更好的治疗效果,本研究的顺利进行,为解决MSCs移植治疗ALF提供了新的思路。结论:(1)胶原凝胶复合MSCs移植能增强MSCs的肝脏定植能力,从而更有效的减轻小鼠ALF;(2)胶原凝胶复合MSCs可通过抑制细胞凋亡,促进细胞增殖来减轻肝损伤;(3)移植胶原凝胶复合MSCs调控PI3K/AKT信号通路改善肝细胞功能。