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子宫内膜异位症(Endometriosis,EMT)是常见的妇科疾病,它是指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆黏膜以外身体其他部位而引起的疾病.虽然提出了多种理论来阐明EMT的发病机制,但其确切机制仍不明确.越来越多的研究表明EMT可能是一种表观遗传学疾病,包括DNA甲基化在内的表观遗传学异常改变可能在EMT发生及发展过程中起重要作用.DNA甲基化状态改变可能是疾病发生的早期分子事件,甲基化状态可因环境因素发生改变,且具有潜在可逆性.因此,进一步探讨DNA甲基化在EMT发生中的作用,有助于了解EMT形成的原因和明确EMT发病的分子机制,为EMT早期诊断及预后评估提供新依据,为EMT的治疗提供一种新途径.
本研究将采用IlluminaHumanMethylation450K芯片分析比较EMT患者在位、异位内膜组织及对照妇女子宫内膜组织DNA的全基因组甲基化状态;应用RT-qPCR检测450K芯片筛出的异常甲基化基因的mRNA水平,间接验证芯片结果;通过转染技术改变相应基因在子宫内膜细胞中的表达来观察其对子宫内膜细胞生物学行为的影响.该研究将进一步阐明DNA甲基化对EMT发生、发展的作用,为深入了解卵巢EMT发生的分子机制提供理论依据.
第一部分卵巢子宫内膜异位症全基因组甲基化检测及结果分析
目的:为进一步明确卵巢EMT患者异位和在位内膜组织DNA甲基化状态改变情况,阐明DNA甲基化对EMT发生、发展的作用.
方法:采用IlluminaHumanMethylation450K甲基化芯片检测了6例卵巢EMT患者在位、异位内膜组织和6例对照妇女子宫内膜组织DNA的全基因组甲基化状态,分析和筛选差异甲基化位点和区域,并对差异位点或区域所在的基因进行聚类分析、基因本体论分析和KEGG信号通路分析.
结果:与对照内膜组织相比,卵巢EMT患者在位内膜组织DNA存在1310个差异甲基化位点及206个差异甲基化启动子区,基因本体论分析这些差异甲基化启动子区所在基因的生物学功能,主要涉及细胞表面受体信号转导、激素代谢、上皮细胞分化、细胞迁移、免疫反应、血管生成、细胞运动、防御反应及补体激活等.卵巢EMT患者异位内膜组织DNA与正常对照内膜相比存在14029个差异甲基化CpG位点及454个差异甲基化启动子区,对这些甲基化启动子区所在的基因进行功能分析,富集的GO条目主要集中在免疫反应、激素刺激反应、防御反应、激活MAPK信号通路、炎症反应、调控细胞增殖、调控细胞凋亡等生物过程.
结论:卵巢EMT患者在位、异位内膜组织存在DNA甲基化异常改变,这些异常甲基化的基因富集在多个与EMT发病相关的信号通路上.
第二部分卵巢子宫内膜异位症全基因组甲基化检测结果验证
目的:为了验证我们的InfiniumHumanMethylation450K芯片结果,本研究选取450K芯片筛出的5个甲基化差异显著的基因(GSTM1、SCIN、HOXB1、MEIS1、TBX3),通过分析比较这些基因mRNA在三组内膜组织中的表达情况,从而间接验证我们的芯片结果.
方法:采用RT-qPCR检测这5个基因在20例卵巢EMT患者在位、异位内膜组织和20例对照女性子宫内膜组织中的mRNA表达情况.
结果:在位、异位内膜组织中启动子区呈低甲基化状态的GSTM1、SCIN和HOXB1基因,其mRNA表达显著高于对照内膜组织;启动子区呈高甲基化状态的MEIS1和TBX3基因,其mRNA表达显著低于对照内膜组织.
结论:RT-qPCR检测结果间接证实了450K芯片结果的可靠性,并表明卵巢EMT患者内膜组织的异常甲基化状态可能对其基因表达有调控作用.
第三部分GSTM1对子宫内膜腺上皮细胞增殖和凋亡的影响
目的:选取异位、在位和对照三组内膜组织中甲基化水平差异最显著的GSTM1基因,采用体外研究探讨其在卵巢EMT发生、发展中可能作用机制.
方法:原代培养子宫内膜腺上皮细胞,应用腺病毒转染技术将pENTER-GSTM1质粒转入子宫内膜腺上皮细胞使GSTM1在细胞中过表达;CCK-8法检测GSTM1表达升高对子宫内膜细胞增殖活性的影响;流式细胞技术检测GSTM1表达升高对子宫内膜细胞凋亡的影响;Westernblot检测GSTM1表达上调后细胞中ASK1及p-ASK1的表达情况;此外应用去甲基化试剂"地西他滨"处理子宫内膜腺上皮细胞,使GSTM1基因去甲基化后,用RT-qPCR检测GSTM1mRNA表达情况.
结果:pENTER-GSTM1质粒转染腺上皮细胞48h后,GSTM1的mRNA及蛋白表达水平显著高于转染空质粒组(P<0.05);CCK-8结果显示,在雌、孕激素撤退处理的情况下,pENTER-GSTM1转染组子宫内膜腺上皮细胞存活率显著高于空质粒转染组(P<0.05);流式细胞技术结果显示,pENTER-GSTM1转染组子宫内膜腺上皮细胞凋亡数量显著低于空质粒转染组(P<0.05);Westernblot结果显示,pENTER-GSTM1转染组和空质粒转染组ASK1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),而pENTER-GSTM1转染组p-ASK1蛋白表达水平显著低于空质粒转染组(P<0.05);经"地西他滨"处理GSTM1基因去甲基化后,RT-qPCR结果显示去甲基化组子宫内膜腺上皮细胞GSTM1基因mRNA表达水平显著高于未处理组(P<0.05).
结论:GSTM1表达升高能够促进子宫内膜腺上皮细胞体外的增值、抑制子宫内膜腺上皮细胞凋亡、下调p-ASK1蛋白的表达,GSTM1基因去甲基化后其mRNA表达升高.
本研究将采用IlluminaHumanMethylation450K芯片分析比较EMT患者在位、异位内膜组织及对照妇女子宫内膜组织DNA的全基因组甲基化状态;应用RT-qPCR检测450K芯片筛出的异常甲基化基因的mRNA水平,间接验证芯片结果;通过转染技术改变相应基因在子宫内膜细胞中的表达来观察其对子宫内膜细胞生物学行为的影响.该研究将进一步阐明DNA甲基化对EMT发生、发展的作用,为深入了解卵巢EMT发生的分子机制提供理论依据.
第一部分卵巢子宫内膜异位症全基因组甲基化检测及结果分析
目的:为进一步明确卵巢EMT患者异位和在位内膜组织DNA甲基化状态改变情况,阐明DNA甲基化对EMT发生、发展的作用.
方法:采用IlluminaHumanMethylation450K甲基化芯片检测了6例卵巢EMT患者在位、异位内膜组织和6例对照妇女子宫内膜组织DNA的全基因组甲基化状态,分析和筛选差异甲基化位点和区域,并对差异位点或区域所在的基因进行聚类分析、基因本体论分析和KEGG信号通路分析.
结果:与对照内膜组织相比,卵巢EMT患者在位内膜组织DNA存在1310个差异甲基化位点及206个差异甲基化启动子区,基因本体论分析这些差异甲基化启动子区所在基因的生物学功能,主要涉及细胞表面受体信号转导、激素代谢、上皮细胞分化、细胞迁移、免疫反应、血管生成、细胞运动、防御反应及补体激活等.卵巢EMT患者异位内膜组织DNA与正常对照内膜相比存在14029个差异甲基化CpG位点及454个差异甲基化启动子区,对这些甲基化启动子区所在的基因进行功能分析,富集的GO条目主要集中在免疫反应、激素刺激反应、防御反应、激活MAPK信号通路、炎症反应、调控细胞增殖、调控细胞凋亡等生物过程.
结论:卵巢EMT患者在位、异位内膜组织存在DNA甲基化异常改变,这些异常甲基化的基因富集在多个与EMT发病相关的信号通路上.
第二部分卵巢子宫内膜异位症全基因组甲基化检测结果验证
目的:为了验证我们的InfiniumHumanMethylation450K芯片结果,本研究选取450K芯片筛出的5个甲基化差异显著的基因(GSTM1、SCIN、HOXB1、MEIS1、TBX3),通过分析比较这些基因mRNA在三组内膜组织中的表达情况,从而间接验证我们的芯片结果.
方法:采用RT-qPCR检测这5个基因在20例卵巢EMT患者在位、异位内膜组织和20例对照女性子宫内膜组织中的mRNA表达情况.
结果:在位、异位内膜组织中启动子区呈低甲基化状态的GSTM1、SCIN和HOXB1基因,其mRNA表达显著高于对照内膜组织;启动子区呈高甲基化状态的MEIS1和TBX3基因,其mRNA表达显著低于对照内膜组织.
结论:RT-qPCR检测结果间接证实了450K芯片结果的可靠性,并表明卵巢EMT患者内膜组织的异常甲基化状态可能对其基因表达有调控作用.
第三部分GSTM1对子宫内膜腺上皮细胞增殖和凋亡的影响
目的:选取异位、在位和对照三组内膜组织中甲基化水平差异最显著的GSTM1基因,采用体外研究探讨其在卵巢EMT发生、发展中可能作用机制.
方法:原代培养子宫内膜腺上皮细胞,应用腺病毒转染技术将pENTER-GSTM1质粒转入子宫内膜腺上皮细胞使GSTM1在细胞中过表达;CCK-8法检测GSTM1表达升高对子宫内膜细胞增殖活性的影响;流式细胞技术检测GSTM1表达升高对子宫内膜细胞凋亡的影响;Westernblot检测GSTM1表达上调后细胞中ASK1及p-ASK1的表达情况;此外应用去甲基化试剂"地西他滨"处理子宫内膜腺上皮细胞,使GSTM1基因去甲基化后,用RT-qPCR检测GSTM1mRNA表达情况.
结果:pENTER-GSTM1质粒转染腺上皮细胞48h后,GSTM1的mRNA及蛋白表达水平显著高于转染空质粒组(P<0.05);CCK-8结果显示,在雌、孕激素撤退处理的情况下,pENTER-GSTM1转染组子宫内膜腺上皮细胞存活率显著高于空质粒转染组(P<0.05);流式细胞技术结果显示,pENTER-GSTM1转染组子宫内膜腺上皮细胞凋亡数量显著低于空质粒转染组(P<0.05);Westernblot结果显示,pENTER-GSTM1转染组和空质粒转染组ASK1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),而pENTER-GSTM1转染组p-ASK1蛋白表达水平显著低于空质粒转染组(P<0.05);经"地西他滨"处理GSTM1基因去甲基化后,RT-qPCR结果显示去甲基化组子宫内膜腺上皮细胞GSTM1基因mRNA表达水平显著高于未处理组(P<0.05).
结论:GSTM1表达升高能够促进子宫内膜腺上皮细胞体外的增值、抑制子宫内膜腺上皮细胞凋亡、下调p-ASK1蛋白的表达,GSTM1基因去甲基化后其mRNA表达升高.