微生物在自然界以群落形式广泛存在。人体从内到外充满着数以亿计的微生物,其中绝大多数栖息在人体的肠道内,它们参与了人体的营养吸收、生长发育、新陈代谢、免疫分化以及保护机体免受病原体的侵害等多个方面,并发挥着重要的功能。然而肠道菌群很容易受到外界因素的干扰,譬如饮食结构、生活习惯改变、益生菌和抗生素的应用等等,其中最被我们所熟知也是影响最为显著的就是抗生素。抗生素作为一种杀菌药物自发现以来一直广泛应用于医疗、农业、畜牧业等各种领域,然而其滥用不仅会加剧耐药性病原菌的传播和转移,同样会破坏人体与菌群的相互关系。肠道菌群一旦紊乱将会导致一系列的功能性障碍和疾病,例如肥胖、腹泻、炎症性肠炎(IBD)、糖尿病(Ⅰ型和Ⅱ型)、大肠癌、自闭症、哮喘等等。认清肠道菌群是如何影响人体的健康与疾病,需要我们将关注点从过去只针对个别的病原体,转移以整体的角度研究菌群上来,特别是阐明正常的肠道菌群群落结构以及当疾病发生时它们有何异常的差异。利用第二代测序技术对细菌16S rRNA进行检测,具有通量高,成本低廉的优点,能够显著的改善传统微生物研究方法的不足,获得比较理想的微生物群落数据,为我们研究微生物生态学奠定了良好的方法学基础。研究目的：1、探求粪便总细菌基因组DNA高通量提取方法。建立不同浓度的煮沸法提取大鼠粪便基因组总DNA,并与常用商业DNA提取试剂盒法进行比较,通过分析不同DNA提取方法的α、β多样性以及菌群结构,并重点比较他们中高丰度水平的OTU的统计学差异,以揭示不同DNA提取方法之间的异同,从而寻找快速、经济、高效、稳定的DNA提取方案,为后期的研究分析奠定基础。2、比较不同给药方式对小鼠肠道菌群的影响。选择第三代头孢菌素头孢噻肟钠,对BALB/C小鼠使用皮下注射和饮水口服两种给药方式同时给药,并收集给药前期、给药中期、停药后期三阶段的粪便样品,通过对不同给药阶段以及不同给药方式的小鼠的肠道菌群进行比较,评估头孢噻肟钠不同给药方式对小鼠肠道菌群结构以及多样性的影响,并追溯其停药后的恢复过程。3、比较不同抗生素对小鼠肠道菌群的影响。选择四大类共六种抗生素,分别是p-内酰胺类(头孢曲松钠、头孢哌酮钠舒巴坦钠、美罗培南)、喹诺酮类(左氧氟沙星)、糖肽类(万古霉素)、大环内酯类(阿奇霉素),对BALB/C小鼠进行皮下注射给药,并收集给药前期、给药中期、停药后期三阶段的粪便样品,评价不同类型的抗生素,以及同类型的不同药物对小鼠肠道菌群结构和多样性的作用,并比较停药后各自的恢复过程,拟探讨抗生素对肠道菌群的影响,并为寻求耐药机制提供线索,同时为我们探索抗生素长期或是反复作用提供研究基础。研究方法：1、我们于成年健康SD大鼠肛门,直接收集新鲜粪便置于灭菌的5m1离心管中,-80℃冷冻保存。分别采用直接煮沸法：以0.5m1无菌EP管取1mgCBoil.1)、3mg (Boil.3)、5mg (Boil.5)、10mg (Boil.10)、30mg (Boil.30)鼠粪,分别加入100u1无菌ddH2O后振荡均匀,先后经过100℃15min,0℃10min。最后经13000xg4℃离心5min后,取上清置于新的干净离心管中,作为DNA模板。商业试剂盒法：选取MO BIO UltraClean Fecal DNA Isolation Kit(MO BIO)、 Qiagen QIAmp DNA mini KIT(Qiagen)、TIANGEN TIANamp Stool DNA kit (TG)、BIOEASY粪便总DNA磁珠法提取试剂盒(BMag)、BIOEASY细菌／细胞／动物组织基因组DNA过柱法(BCL)共五种常用商业试剂盒,按照各试剂盒说明说提取大鼠粪便总DNA,并溶于50ul TE缓冲液中。所有提取DNA模板置于-200C保存备用。2、我们将24只雄性BALB/C小鼠随机分为3组(8只/组),保证每组小鼠的体重分布相一致。在预养一周后,对实验组小鼠分别以皮下注射(CTX.i)与自然饮水口服(CTX.o)的方式进行为期4天的短期头孢噻肟钠给药,对照组(CK)小鼠不做任何处理。分别收集各组小鼠给药前期(Ⅰ.1、Ⅰ.2、Ⅰ.3),给药中期(Ⅱ.1、Ⅱ.2、Ⅱ.3、Ⅱ.4),停药后期Ⅲ.1、Ⅲ.2、Ⅲ.3、Ⅲ.4、Ⅲ.、Ⅲ.6、 Ⅲ.7、Ⅲ.14、Ⅲ.30、Ⅲ.90)三个时期的粪便样品,所有的样品取样后立即置于-80℃冷冻保存。根据体重记录,每组除去体重偏离中位数最远的2只小鼠,对剩余6只小鼠的粪便进行DNA提取。3、我们将56只雄性BALB/C小鼠随机分为7组(8只/组),保证每组小鼠的体重分布相一致。在预养一周后,对各组小鼠分别进行为期的3天的短期给药。各组小鼠按照编号分别皮下注射头孢曲松钠(CTR)、盐酸左氧氟沙星(OFL)、头孢哌酮钠舒巴坦钠(CPZ)、万古霉素(VAN)、美罗培南(MEC)、阿奇霉素(AZI),对照组(CK)小鼠注射等体重比的生理盐水。分别收集给药前期(Ⅰ.1、Ⅰ.2),给药中期(Ⅱ.1、Ⅱ.2、Ⅱ.3),停药后期(Ⅲ.1、Ⅲ.2、Ⅲ.3、Ⅲ.4、 Ⅲ.、Ⅲ.6、Ⅲ.7、Ⅲ.14、Ⅲ.30、Ⅲ.90)三个时期的粪便样品,所有的样品取样后立即置于-80℃冷冻保存。根据体重记录,每组除去体重偏离中位数最远的2只小鼠,对剩余6只小鼠的粪便进行DNA提取。我们以16s rRNA V6区域带barcode的通用引物对所有提取的DNA进行PCR扩增。扩增后的PCR产物经过混合、纯化之后送至华大基因公司以Illumina Hiseq2000测序仪进行PE75测序。测序数据我们采用barcoded Illumina paired-end sequencing(BIPES)分析流程进行提取和初步处理,使用UCHIME筛选去除嵌合体；所得干净序列经Two-Stage-Clustering(TSC)以97%的相似度聚类成OTU(Operational Taxonomic Unit),并采用Global Alignment for Sequence Taxonomic(GAST)算法对其进行分类；采用mothur来获得样品的α多样性信息；基于UniFrac距离,采用QIIME进行主成分分析；采用linear discriminant analysis (LDA) coupled with effect size measurements(LEfSe)在线工具寻找有组与组之间有统计学差异的Biomarker。应用SPSS13.0统计软件进行统计分析,P<0.05时差异具有统计学意义。研究结果：1、采用直接煮沸法直接提取粪便样品DNA,所得到的菌群结构与使用商业试剂盒类似。当采用较少量的粪便样品进行直接煮沸法提取DNA时,会造成α多样性被低估,然而当粪便样品量达到10-30mg时,所得到的α多样性结果与采用200mg粪便进行提取的商业试剂盒相一致。p多样性与菌群结构的分析表明,直接煮沸法与除MO BIO之外的大部分试剂盒结果相一致。此外,几乎所有中高丰度的OTU在所有的方法,包括直接煮沸法和试剂盒法中,都能够被检测到,这表明我们可以选用一致的方法更为有效的研究OTU在时间和空间上的变化。直接煮沸法仅使用少量的粪便(如10mg),能够最大程度的降低对样品量的需求,更适用于一些珍贵或取样量较少的样品,并且能显著降低DNA提取的成本以及提高提取效率,为制备大批量样品提供了新的解决之路,这对我们后续的研究起着重要的作用。2、经头孢噻肟钠给药的小鼠其肠道菌群的α多样性从给药第二天开始出现显著性下降,这种低水平的α多样性并没有随着头孢噻肟钠的停用而立刻恢复,而是持续了两周的时间。而p多样性同样给我们展示了头孢噻肟钠对小鼠肠道菌群所造成的剧烈影响,这种菌群结构上的改变比起a多样性来更为持久和难以恢复,在停药后两周的时间点上依然存在着显著性差异。由此可得知,哪怕只是短时间的正常用药,头孢噻肟钠也会对小鼠肠道菌群造成严重的影响,这种影响同时体现在α和p多样性上,并远比我们想象中漫长。通过采用LEfSe对生物标志物的寻找,我们发现经头孢噻肟钠给药的小鼠,其肠道内微生物在门水平上Bacteroidetes, Proteobacteria和Actinobacteria几乎完全消失,而Firmicutes大量滋生。特别是对于有益菌Lactobacillus造成了灾难性的破坏,并恢复过程缓慢；而Clostridium, Bacillus和Enterococcus相对于对照组正常小鼠有着显著性的增加。这种群落多样性下降而Clostridum水平上升与艰难梭菌腹泻(CDAD),特别是复发性CDAD相关。另一方面,口服给药法给小鼠肠道细菌的总量造成了严重的影响,导致PCR以及后期测序所得序列均较不理想。但是从未经标准化序列进行UniFrac的结果以及所有能够分析的数据上,我们可以看到注射和口服两种给药途径对小鼠肠道菌群造成影响的趋势基本是相似的。这予我们启示,即为了保证后期测序分析的质量,在同时存在口服和注射给药途径的情况下可以首选注射给药。3、本研究表明,所有的抗生素都会对小鼠肠道菌群α多样性造成影响,其中OFL与AZI对小鼠肠道菌群a多样性的影响相对较轻微,在停药后第4天均已恢复到正常水平；而CTR、CPZ、VAN与MEC对α多样性影响则更为相似,在停药后两周才基本恢复正常。从p多样性的角度来看,OFL与AZI对小鼠肠道菌群的影响并不是十分显著,CTR组、CPZ组、VAN组与MEC组的肠道菌群则都在给药的第二天发生了剧烈的变化。并且不同的抗生素对于不同丰度的OTU的具有选择性作用,CTR、CPZ和MEC这三种药物主要作用于肠道菌群中一些丰度不高的OTU上,VAN组则更多地作用于一些中高丰度的OTU上。另一方面,随着药物的停用,不同的抗生素也表现出不同的恢复趋势。CTR组与MEC组的肠道菌群到停药后第14天才恢复到正常,而CPZ组到停药后第30天才恢复,VAN组更是直到停药后第90天才完全恢复正常。从菌群结构上我们可以发现,在门水平级别上,β-内酰胺类的抗生素组的三种药物变化更为相似,均以抗生素作用下Firmicutes增加,Bacteroidetes与Proteobacteria减少为特征；然而具体三种药物的作用仍有一定的区别,CPZ组Firmicutes水平的升高主要发生于停药后期,而CTR与MEC主要发生于给药中期。OFL组与AZI组变化呈现轻微的波动但不明显,OFL组可以观察到Proteobacteria水平随着给药开始下降,并直到观察期结束依然保持着较低水平。VAN组显现出明显异于其他给药组的菌群变化,即Firmicute水平随着给药大幅度下降,而Proteobacteria则占据了小鼠肠道菌群中的主导地位。进一步从属水平上可以发现,只有VAN组反常的在给药中期出现了Escherichia增高的情况,造成这点的原因主要是由于万古霉素的杀菌谱重点偏向于杀灭革兰氏阳性菌,从而造成革兰氏阴性菌的定植与增生。而VAN组在停药2周之后,Clostridium水平略有增加,并在整个观察期结束时仍未恢复,我们推测此为VAN对小鼠肠道菌群的所造成远期影响之一。喹诺酮类药物OFL对小鼠肠道菌群的影响相对较轻微,为我们临床用药选择提供了指导和借鉴。大环内酯类药物AZI主要作用于Bacteroidetes门的细菌,并对于丰度较低的菌属影响较大。此外,三种β-内酰胺类药物的抗生素(CTR、CPZ、MEC)在杀菌谱上表现出了一定的一致性,都是以杀灭Firmicutes和Bacteroidetes为主的菌群并造成Clostridium大量增生,这点在其他类型的抗生素上并未有相似表现。综合前研究头孢噻肟钠我们可以发现惊人的一致性,这种多样性降低而Clostridium增长的趋势有可能p-内酰胺类抗生素易导致艰难梭菌感染的一个重要原因。尽管如此,β-内酰胺的三种抗生素有他们各自的作用特点,譬如CTR组与MEC组的Clostridium水平随着药物的给予立即上升,而CPZ组的Clostridium水平最高峰反而出现在停药后期,其恢复过程也不尽相同。研究结论：1、本研究建立了粪便直接煮沸法,并证明了其与普通商业试剂盒法无显著差异,为后期实验能够快速、有效、经济的对大批量样品进行DNA提取提供了基础。2、尽管只是短期用药,头孢噻肟钠依然会对小鼠肠道菌群结构和多样性造成严重的影响,并且这一影响随着药物的停用依然会持续较长一段时间。此外,不同的给药方式对小鼠肠道菌群的影响趋势相一致。3、不同的抗生素拥有不同的抗菌谱,在给药中期会对小鼠肠道菌群造成不同的作用,而药物停用之后不同的抗生素给药组恢复时间以及菌群变化情况也大相径庭,其中某些药物的恢复情况为我们临床更合理的使用抗生素提供线索。