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DNA甲基化是一种重要的表观遗传现象,与基因表达调控、基因印迹等密切相关。马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)作为我国重要的海水珍珠培育贝类之一,其矿化机制、免疫防御系统一直受到研究者的关注。对马氏珠母贝外套膜DNA甲基化的研究有助于了解DNA甲基化与贝类的矿化、免疫机制的关系。本研究对马氏珠母贝外套膜三个区域开展DNA甲基化基础研究,筛选甲基化修饰差异基因并进行功能验证。主要研究结果如下:(1)通过甲基化敏感多态性扩增技术,检测马氏珠母贝外套膜的边缘膜区(Mantle edge,ME),套膜区(Mantle pallial,MP)和中央膜区(Mantle central,MC)基因组DNA甲基化修饰水平。结果显示ME、MP、MC的基因组甲基化水平分别为(17.02±1.98)%、(14.46±1.94)%、(19.04±2.55)%,具有显著性差异(P<0.05);基因组的基因组甲基化水平由高到低排列依次是MC>ME>MP;对特异性片段进行回收测序获得iHog(interference hedgehog)并进行定量分析,iHog在ME,MP和MC中均有表达,以ME表达量最高,MC表达量最低,差异显著,其与甲基化修饰呈现负相关(P<0.05),推测iHog的DNA序列的甲基化修饰抑制了该基因在Mc组织中的表达。(2)使用DNA甲基化免疫共沉淀测序法(MeDIP-Seq)筛选ME和MC之间的DNA甲基化修饰差异基因。测序结果显示ME、MC都得到122 M条原始Reads,以及分别获得58702和55721条Peaks。通过生物信息学分析得到ME和MC具甲基化修饰差异基因约311个;挑选具甲基化修饰差异基因TRAF2、TRAF3以及MyD88基因进行荧光定量验证,结果表明三个基因在ME、MC上的表达具有差异(P<0.05)。(3)通过RACE技术成功获得Pm-My D88的序列全长1591 bp,共编码358个氨基酸;实时荧光定量PCR表明Pm-MyD88基因mRNA在鳃的表达量最高;LPS刺激后,其表达水平在12 h时达到最高水平(P<0.05);原位杂交试验则表明Pm-MyD88存在于血淋巴细胞中,并伴随LPS刺激而表现出较强的阳性信号;共转染pcDNA3.1-Pm-MyD88重组质粒能使p NFκB-Luc的相对双荧光素酶活性提高1.9372倍;软件分析获得miR-4047为Pm-MyD88的调控miRNA,体内过表达miR-4047后,Pm-MyD88基因的表达量下调90.16%(P<0.05),下游基因NF-kB和IL-17的表达量分别下调97.09%(P<0.05)和99.99%(P<0.01);双荧光素酶共转染实验表明Pm-My D88-3’UTR重组质粒共转染miR-4047后,其相对荧光素酶活性下降36.95%;以上实验结果表明Pm-My D88能够参与并激活NFkB信号通路,且miR-4047和Pm-MyD88具有靶向关系。(4)利用RACE技术获得甲基转移酶:Pm-Dnmt1、Pm-Dnmt1b、Pm-Dnmt3a、Pm-Dnmt3b的cDNA序列全长,分别为4848 bp、2661 bp、2405 bp、2775 bp、其各自编码1550、797、705和803个氨基酸。实时荧光定量PCR分析显示四个基因在全组织中均有表达,其中除Pm-Dnmt1在中央膜中的表达量最高(P<0.05),余下3个基因mRNA均在性腺中的表达量最高(P<0.05),推测Pm-Dnmt1可通过DNA甲基化协同参与贝壳的形成。DNA甲基转移酶抑制剂(Decitabine,DAC)去甲基化实验结果则表明:DAC处理后甲基转移酶在ME、MC上的表达均明显下降,TRAF2、TRAF3以及MyD88基因的表达量则显著上调(P<0.05)。