转录组学的研究可以提供特定条件下基因表达谱,蕴含着非常丰富的生物学信息。与把RNA从组织中提取出来观察的传统转录组分析方法相比,原位测序技术在保留RNA的原始空间位置的前提下,同时获得其表达丰度。与此同时,原位测序技术在探针设计中引入了条形编码标记,避免了光谱重叠对检测样本数量的限制,通过对探针中设计的四个碱基进行连接测序,理论上可以实现4~4=256个的高度多重化的原位检测。鉴于原位测序技术广泛的生物学应用价值,我们对基于锁式探针和滚环扩增的RNA原位测序技术进行了改进:首先,应用双连接探针策略,在提高检测效率的同时保持的特异性;其次,将原有的测序探针上的其中5个简并碱基改为确定碱基,通过提高杂交效率从而增强测序信号点的亮度;第三,改为双端测序减少了测序过程中的效率损失,有助于提高后续轮次的信号亮度。在对改进后的原位测序技术进行一系列条件优化后,我们将该技术应用于结直肠癌临床石蜡组织切片上,分析了111个相关基因的表达丰度和空间分布。得到的原位测序结果展示了组织内的免疫概况和肿瘤内异质性,并与苏木精-伊红染色得到的结果相互佐证,用以划分肿瘤区域和基质区域。我们通过Insitu Net应用程序得到了两种区域截然不同的空间基因共表达网络图。最后,我们还将改进后的原位测序技术应用于胚胎大脑基底神经节的基因表达图谱的建立,在该矢状切面的冰冻样本上我们用原位测序技术对54个基因进行了同步检测。从测序结果中观察到了不同区域之间的基因表达差异,对基底神经节的细胞亚群的区分提供了信息。综上所述,我们建立了一种可以应用于细胞爬片、石蜡和冰冻组织切片原位测序技术,可以实现基因表达的定量和定位分析,可以结合其他形态学分析方法、单细胞测序技术等对细胞亚群的空间分布和基因图谱进行探究,为极为广泛的研究方向提供一种新的工具。