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研究背景HLA-G属于非经典HLA Ib类蛋白,限制性表达于胚胎绒毛膜外滋养层细胞,在妊娠过程中调控母胎免疫耐受。HLA-G5为结构最为完整的可溶性HLA-G蛋白,在胚胎着床中作用尤为重要。HLA-G在妊娠过程中的调控作用主要包括：1.增加子宫内膜容受性；2.调控胚胎生长、分化和发育；3.维持妊娠过程中子宫内膜免疫细胞对胚胎的免疫耐受。但是目前已知的HLA-G功能多局限于免疫学功能,HLA-G是否存在非免疫学功能尚不清楚。本研究主要关注可溶性HLA-G5蛋白对胚胎滋养层细胞和子宫内膜细胞的非免疫学作用。研究目的1.构建原核表达系统,表达并纯化可溶性HLA-G5重组蛋白；2.研究HLA-G5重组蛋白对胚胎滋养层细胞侵袭能力的影响及机制；3.研究HLA-G5重组蛋白对子宫内膜上皮细胞容受性的影响及机制。研究方法1.应用PCR、Western blot和免疫荧光方法检测胚胎滋养层细胞(JAr、JEG-3和原代滋养层细胞)和子宫内膜上皮细胞(Ishiakwa)中HLA-G5及其受体KIR2DL4和LILRB1表达；2.应用过PCR方法从HLA-G阳性细胞系JEG-3中扩增HLA-G5cDNA,将之转化入E. coli BL21系统,在30℃、IPTG诱导下建立HLA-G5原核细胞蛋白表达体系,利用蛋白重构试剂盒将HLA-G5重组蛋白纯化并重构；3.应用微量蛋白荧光标记试剂盒标记HLA-G5重组蛋白,通过流式细胞术检测HLA-G5与细胞的结合能力；4.使用细胞增殖检测试剂盒检测HLA-G5重组蛋白对胚胎滋养层细胞和子宫内膜细胞增殖能力的影响；5.使用细胞迁移能力试剂盒检测HLA-G5重组蛋白对胚胎滋养层细胞和子宫内膜细胞迁移能力的影响；6.使用Transwell小室检测HLA-G5重组蛋白对JAr和JEG-3细胞侵袭能力的影响；7.应用ELISA和Cytokine Array方法检测HLA-G5重组蛋白对胚胎滋养层细胞和子宫内膜细胞培养液中细胞因子(IL-2、IL-10、IL-6、TNF-α、IFN-γ)的影响；8.应用实时荧光定量PCR方法检测HLA-G5重组蛋白对JAr和JEG-3细胞中蛋白酶uPA和MMPs表达水平的影响；使用uPA活性检测试剂盒测定HLA-G5重组蛋白对JAr和JEG-3细胞分泌的蛋白酶uPA活性的影响；采用明胶酶谱法检测HLA-G5重组蛋白处理后JAr和JEG-3细胞分泌蛋白酶MMP2和MMP9活性的变化；9.应用Western blot方法检测影响胚胎滋养层细胞侵袭能力的信号传导通路,在侵袭实验中使用信号通路抑制剂验证；10.采用胚胎滋养层细胞球(JAr)与单层子宫内膜细胞(Ishikawa)共培养体外模型模拟胚胎着床,检测HLA-G5重组蛋白对胚胎滋养层细胞球(JAr)与单层子宫内膜细胞(Ishikawa)粘附率的影响；11.检测HLA-G5重组蛋白对Ishikawa细胞中粘附蛋白E-cadherin和β-catenin的影响；12.所有实验中对照组为未经HLA-G5处理组,通过Sigma Plot11.0软件应用t检验或单因素方差分析方法(数据为非正态分布时,采用非参数检验)对所得数据进行统计学分析。结果1.在pET-15b载体中插入HLA-G5基因,并于大肠杆菌BL21中表达HLA-G5重组蛋白,基因序列和蛋白质序列与野生型相比无突变；HLA-G5重组蛋白经过纯化和重构,具有生物学功能；2. JEG-3细胞表达HLA-G5蛋白,JAr和Ishikawa细胞不表达HLA-G5蛋白；JEG-3、JAr和Ishikawa细胞均表达HLA-G5受体KIR2DL4和LILRB1;3. HLA-G5重组蛋白能够与JAr、JEG-3和Ishikawa田胞特异性结合；4.1μg/mL HLA-G5重组蛋白不影响胚胎滋养层细胞(JAr和JEG-3)和子宫内膜上皮细胞(Ishikawa)增殖能力和迁移能力；5.1μg/mL HLA-G5重组蛋白能够使JAr和JEG-3细胞侵袭能力分别增强至(189.52±19.74)%和(148.39±38.18)%;6.1μg/mLHLA-G5增加JAr和JEG-3细胞中蛋白酶uPA和MMPs的表达和活性；7.1μg/mL HLA-G5重组蛋白不影响JAr和JEG-3细胞培养液中IL-6水平；1μg/mL HLA-G5重组蛋白处理24小时后,子宫内膜细胞(Ishikawa)培养液中IL-6分泌水平降低；8.1μg/mL HLA-G5重组蛋白处理JAr和JEG-3细胞5分钟至30分钟后,细胞中MAPK信号传导通路中的ERK和SAPK/JUN磷酸化水平增加；ERK和SAPK/JUN抑制剂能够抑制JAr和JEG-3细胞侵袭能力；9. HLA-G5重组蛋白使胚胎滋养层细胞球(JAr)和子宫内膜单层细胞(Ishikawa)的粘附率增加；10.HLA-G5重组蛋白处理Ishikawa田胞30分钟后,细胞粘附因子E-cadherin和β-catenin表达水平下降。结论1.成功构建HLA-G5蛋白原核表达系统,能够得到大量、高纯度HLA-G5重组蛋白；2. HLA-G5重组蛋白可以增强胚胎滋养层细胞的侵袭能力,这一作用通过胚胎滋养层细胞上HLA-G5受体KIR2DL4和LILRB1介导,通过增强细胞蛋白酶MMPs和uPA的转录水平和蛋白酶活性实现,其中涉及MAPKs(?)胞信号转导通路；3. HLA-G5能够增加胚胎滋养层细胞球和子宫内膜单层细胞的粘附率,这一作用可能通过其受体KIR2DL4和LILRB1介导,与子宫内膜细胞分泌的细胞因子(IL-6)及粘附因子(E-cadherin和β-catenin)下调有关。